Calorimetría de titulación isotérmica

Técnica química

MicroCal. VP-ITC en una caja de guantes.

En termodinámica química , la calorimetría de titulación isotérmica ( ITC ) es una técnica física utilizada para determinar los parámetros termodinámicos de las interacciones en solución . ^{[1] [2]} Se utiliza con mayor frecuencia para estudiar la unión de moléculas pequeñas (como compuestos medicinales) a macromoléculas más grandes ( proteínas , ADN , etc.) en un entorno sin etiquetas. ^{[3] [4]} Consiste en dos celdas encerradas en una camisa adiabática . Los compuestos a estudiar se colocan en la celda de muestra, mientras que la otra celda, la celda de referencia, se utiliza como control y contiene el tampón en el que se disuelve la muestra.

La técnica fue desarrollada por HD Johnston en 1968 como parte de su tesis doctoral en la Universidad Brigham Young, ^[5] y se consideró de nicho hasta que MicroCal Inc. la introdujo comercialmente en 1988. En comparación con otros calorímetros, el ITC tiene la ventaja de no requerir ningún corrector ya que no había intercambio de calor entre el sistema y el medio ambiente.

Mediciones termodinámicas

Termograma ITC

La ITC es una técnica cuantitativa que puede determinar la afinidad de enlace ( ), la entalpía de reacción ( ) y la estequiometría de enlace ( ) de la interacción entre dos o más moléculas en solución. Esto se logra midiendo las entalpías de una serie de reacciones de enlace causadas por inyecciones de una solución de una molécula a una celda de reacción que contiene una solución de otra molécula. Los valores de entalpía se grafican sobre las razones molares resultantes de las inyecciones. A partir del gráfico, la entalpía de reacción molar , la constante de afinidad ( ) y la estequiometría se determinan mediante el ajuste de curvas . El cambio de energía libre de Gibbs ( ) y el cambio de entropía ( ) de la reacción se pueden determinar utilizando la relación: ${\displaystyle K_{a}}$ ${\displaystyle \Delta H}$ ${\displaystyle n}$ ${\displaystyle \Delta H}$ ${\displaystyle K_{a}}$ ${\displaystyle \Delta G}$ ${\displaystyle \Delta S}$

${\displaystyle \Delta G=-RT\ln {K_{a}}=\Delta H-T\Delta S}$

(donde es la constante del gas y es la temperatura absoluta ). ${\displaystyle R}$ ${\displaystyle T}$

Para obtener mediciones precisas de la afinidad de unión, la curva del termograma debe ser sigmoidea. El perfil de la curva se determina mediante el valor c, que se calcula mediante la ecuación:

${\displaystyle c=nK_{a}M}$

donde es la estequiometría de la unión, es la constante de asociación y es la concentración de la molécula en la célula. ^{[1] [6] [7]} El valor c debe estar entre 1 y 1000, idealmente entre 10 y 100. En términos de afinidad de unión, estaría aproximadamente entre ~ dentro del rango límite. ^[8] ${\displaystyle n}$ ${\displaystyle K_{a}}$ ${\displaystyle M}$ ${\displaystyle 1.0\times 10^{3}}$ ${\displaystyle 10^{7}}$

Mediciones instrumentales

Esquema de un instrumento ITC

Un calorímetro de titulación isotérmica se compone de dos celdas idénticas hechas de un material conductor térmico y químicamente inerte de alta eficiencia, como la aleación Hastelloy o el oro, rodeadas por una cubierta adiabática . ^{[1] [7]} Se utilizan circuitos sensibles de termopila/termopar para detectar diferencias de temperatura entre la celda de referencia (llena de tampón o agua) y la celda de muestra que contiene la macromolécula. Antes de la adición del ligando, se aplica una potencia constante (<1 mW) a la celda de referencia. Esto dirige un circuito de retroalimentación, que activa un calentador ubicado en la celda de muestra. ^[6] Durante el experimento, el ligando se titula en la celda de muestra en alícuotas conocidas con precisión, lo que hace que se absorba o se desprenda calor (según la naturaleza de la reacción). Las mediciones consisten en la entrada de potencia dependiente del tiempo necesaria para mantener temperaturas iguales entre la muestra y las celdas de referencia. ^[5]

En una reacción exotérmica , la temperatura en la celda de muestra aumenta al agregar el ligando . Esto hace que la potencia de retroalimentación a la celda de muestra disminuya (recuerde: se aplica una potencia de referencia a la celda de referencia) para mantener una temperatura igual entre las dos celdas. En una reacción endotérmica , ocurre lo opuesto; el circuito de retroalimentación aumenta la potencia para mantener una temperatura constante (operación isotérmica). ^[1]

Las observaciones se representan gráficamente como la potencia necesaria para mantener la celda de referencia y la celda de muestra a una temperatura idéntica en función del tiempo. Como resultado, los datos experimentales sin procesar consisten en una serie de picos de flujo de calor (potencia), y cada pico corresponde a una inyección de ligando. Estos picos/pulsos de flujo de calor se integran con respecto al tiempo, lo que da el calor total intercambiado por inyección. El patrón de estos efectos de calor en función de la relación molar [ligando]/[macromolécula] se puede analizar entonces para dar los parámetros termodinámicos de la interacción en estudio.

Para obtener un resultado óptimo, cada inyección debe tener el tiempo suficiente para alcanzar el equilibrio de la reacción. A menudo es necesario desgasificar las muestras para obtener buenas mediciones, ya que la presencia de burbujas de gas dentro de la celda de muestra dará lugar a gráficos de datos anormales en los resultados registrados. Todo el experimento se lleva a cabo bajo control informático. ^[7]

La titulación directa se realiza más comúnmente con ITC para obtener los datos termodinámicos, uniendo dos componentes de la reacción directamente entre sí. Sin embargo, muchas de las reacciones químicas e interacciones de unión pueden tener una afinidad de unión mayor que la deseable con la ventana c. Para solucionar la limitación de la ventana c y las condiciones para ciertas interacciones de unión, se pueden realizar varios métodos diferentes de titulación. En algunos casos, simplemente hacer una titulación inversa cambiando las muestras entre la jeringa de inyección y la celda de muestra puede resolver el problema, dependiendo del mecanismo de unión. ^[9] Para la mayoría de las uniones de alta o baja afinidad, se requiere quelación o titulación competitiva. Este método se realiza cargando una solución compleja preunida en la celda de muestra y quelando uno de los componentes con un reactivo de mayor afinidad de unión observada dentro de la ventana c deseada.

Análisis e interpretación

Post hocAnálisis e inventario de protones

Los datos experimentales recopilados reflejan no solo la termodinámica de enlace de la interacción de interés, sino también cualquier equilibrio competitivo que contribuya a ella. Se puede realizar un análisis post-hoc para determinar la entalpía independiente del solvente o del tampón a partir de la termodinámica experimental, simplemente siguiendo el proceso de la ley de Hess . El siguiente ejemplo muestra una interacción simple entre un ion metálico (M) y un ligando (L). B representa el tampón utilizado para esta interacción y representa protones . ${\displaystyle {\ce {H+}}}$

${\displaystyle {\ce {M - B <=> M + B}}}$ ${\displaystyle {\ce {-\Delta H_{MB}}}}$

${\displaystyle {\ce {L - H <=> L + H+}}}$ ${\displaystyle -(n_{H+})\Delta H_{LH}}$

${\displaystyle {\ce {H+ + B <=> H - B}}}$ ${\displaystyle (n_{H+})\Delta H_{BH}}$

${\displaystyle {\ce {M + L <=> M - L}}}$ ${\displaystyle \Delta H_{ML}}$

Ejemplo de un gráfico de inventario de protones de una interacción de enlace. Se presentan los valores entálpicos promedio obtenidos en tres condiciones de tampón diferentes ( TAPSO , bis-Tris y HEPES ). Los ejes X e Y representan la entalpía de protonación del tampón y la entalpía observada en los experimentos realizados.

Por lo tanto,

${\displaystyle \Delta H_{ITC}=-\Delta H_{MB}-(n_{H+})\Delta H_{LH}+(n_{H+})\Delta H_{BH}+\Delta H_{ML}}$

que puede procesarse aún más para calcular la entalpía de la interacción metal-ligando. ^{[10] [11]} Aunque este ejemplo es entre un metal y un ligando , es aplicable a cualquier experimento de ITC, con respecto a las interacciones de enlace.

Como parte del análisis, se requiere una cantidad de protones para calcular la termodinámica independiente del solvente. Esto se puede hacer fácilmente trazando un gráfico como el que se muestra a continuación.

La ecuación lineal de este gráfico es la versión reorganizada de la ecuación anterior del análisis post-hoc en forma de y = mx + b:

${\displaystyle \Delta H_{ITC}=(n_{H+})\Delta H_{BH}+[-\Delta H_{MB}-(n_{H+})\Delta H_{LH}+\Delta H_{ML}]}$

Constante de equilibrio

La constante de equilibrio de la reacción tampoco es independiente de los demás equilibrios en competencia. La competencia incluiría interacciones con el tampón y otras reacciones dependientes del pH según las condiciones experimentales. La competencia de especies distintas a la especie de interés se incluye en el factor de competencia, Q, en la siguiente ecuación: ^[11]

${\displaystyle Q=\Sigma (\beta _{n}[\mathrm {X} ]_{n})}$

donde, representa especies como un buffer o protones, representa su constante de equilibrio, cuando, ${\displaystyle X}$ ${\displaystyle \beta }$

${\displaystyle K_{ML}=K_{ITC}Q}$

Aplicaciones

Durante los últimos 30 años, la calorimetría de titulación isotérmica se ha utilizado en una amplia gama de campos. En el pasado, esta técnica se utilizaba para determinar valores termodinámicos fundamentales para interacciones moleculares pequeñas básicas. ^[12] En los últimos años, la calorimetría de titulación isotérmica se ha utilizado en áreas con mayor aplicación industrial, como el descubrimiento de fármacos y la prueba de materiales sintéticos . Aunque todavía se utiliza mucho en la química fundamental, la tendencia se ha desplazado hacia el lado biológico, donde los valores independientes del tampón y sin etiqueta son relativamente más difíciles de lograr. ^{[13] [14]}

Cinética enzimática

Utilizando los datos termodinámicos de ITC, es posible deducir la cinética enzimática incluyendo la transferencia de protones o electrones , alosterio y cooperatividad , e inhibición enzimática . ^{[15] [16]} ITC recopila datos a lo largo del tiempo que son útiles para cualquier experimento cinético, pero especialmente con las proteínas debido a alícuotas constantes de inyecciones. En términos de cálculo, la constante de equilibrio y las pendientes de unión se pueden utilizar directamente para determinar el alosterio y la transferencia de carga, comparando datos experimentales de diferentes condiciones ( pH , uso de cadena peptídica mutada y sitios de unión, etc.).

Estudios de membranas y péptidos autoensamblados

Las proteínas de membrana y las propiedades de autoensamblaje de ciertas proteínas se pueden estudiar con esta técnica, debido a que es un calorímetro sin etiquetas . Se sabe que las proteínas de membrana tienen dificultades con la selección de protocolos de solubilización y purificación adecuados. Como ITC es una herramienta calorimétrica no destructiva, se puede utilizar como detector para localizar la fracción de proteína con sitios de unión deseados, mediante la unión de un ligando de unión conocido a la proteína. ^[17] Esta característica también se aplica en estudios de proteínas autoensambladas, especialmente en el uso de la medición de la termodinámica de su transformación estructural . ^[18]

Desarrollo de fármacos

La afinidad de unión tiene una enorme importancia en la química médica, ya que los fármacos deben unirse a la proteína de manera efectiva dentro de un rango deseado. Sin embargo, determinar los cambios de entalpía y optimizar los parámetros termodinámicos son enormemente difíciles al diseñar fármacos. ^[19] ITC resuelve este problema fácilmente al deducir la afinidad de unión, las contribuciones entálpicas/entrópicas y su estequiometría de unión.

Química quiral

Aplicando las ideas anteriores, también se puede deducir la quiralidad de los compuestos organometálicos con esta técnica. ^[20] Cada compuesto quiral tiene sus propias propiedades y mecanismos de unión únicos que son comparables entre sí, lo que conduce a diferencias en las propiedades termodinámicas. Al unir soluciones quirales en un sitio de unión se puede deducir el tipo de quiralidad y, dependiendo del propósito, qué compuesto quiral es más adecuado para la unión.

Interacciones de unión de metales

La unión de iones metálicos a proteínas y otros componentes del material biológico es uno de los usos más populares de la ITC, desde el estudio de unión de ovotransferrina a hierro férrico publicado por Lin et al. de MicroCal Inc. ^[21] Esto se debe a que algunos de los iones metálicos utilizados en sistemas biológicos tienen una configuración electrónica d ¹⁰ que no se puede estudiar con otras técnicas comunes como la espectrofotometría UV-vis o la resonancia paramagnética electrónica . ^{[8] [10]} También está estrechamente relacionado con los estudios bioquímicos y medicinales debido a la gran abundancia de enzimas de unión a metales en los sistemas biológicos. ^[22]

Nanotubos de carbono y materiales relacionados

La técnica se ha utilizado ampliamente en el estudio de nanotubos de carbono para determinar interacciones de enlace termodinámico con moléculas biológicas e interacciones de compuestos de grafeno . ^[23] Otro uso notable de ITC con nanotubos de carbono es la optimización de la preparación de nanotubos de carbono a partir de compuestos de grafeno y alcohol polivinílico (PVA) . El proceso de ensamblaje de PVA se puede medir termodinámicamente ya que la mezcla de los dos ingredientes es una reacción exotérmica, y su tendencia de enlace se puede observar fácilmente mediante ITC.

Véase también

• Calorimetría diferencial de barrido
• Interferometría de polarización dual
• Calorimetría de sorción
• Calorimetría por perturbación de presión
• Resonancia plasmónica de superficie

Referencias

1. Freire, Ernesto; Mayorga, Obdulio L.; Straume, Martin (1990-09-01). "Calorimetría de titulación isotérmica". Química analítica . 62 (18): 950A–9A. doi :10.1021/ac00217a002. ISSN  0003-2700.
2. Grolier, Jean-Pierre E.; del Río, José Manuel (2012). "Calorimetría de titulación isotérmica: una interpretación termodinámica de las mediciones". The Journal of Chemical Thermodynamics . 55 : 193–202. Código Bibliográfico :2012JChTh..55..193G. doi :10.1016/j.jct.2012.05.018.
3. Serdyuk; Zaccai; Zaccai (2017). "Calorimetría de titulación isotérmica C3". Métodos en biofísica molecular: Estructura, dinámica, función . Cambridge University Press. págs. 221–233. doi :10.1017/CBO9780511811166. ISBN . 978-0-511-64901-1.
4. Kuriyan; Conforti; Wemmer (2013). "12.23 La calorimetría de titulación isotérmica nos permite determinar los componentes entálpicos y entrópicos de la energía libre de enlace". Las moléculas de la vida: principios físicos y químicos . Garland Publishing. págs. 573–7.
5. Johnston, HD (1968). Termodinámica (log K, ΔH°, ΔS°, ΔCp°) de la interacción metal-ligando en solución acuosa (PhD). Universidad Brigham Young.
6. Inicio rápido: calorimetría de titulación isotérmica (ITC) (2016). TA Instrument. New Castle, DE.
7. VP-ITC (2001). Microcal Inc., Northampton, MA.
8. Stevenson, MJ (2016) Estudios termodinámicos de la unión de iones metálicos Cu(I) y otros d ^{10 a proteínas en la vía de homeostasis del cobre y la vía de desintoxicación organomercurial. Dartmouth College.}
9. Grolier, Jean-Pierre E.; del Río, Jose Manuel (2015). "Calorimetría de titulación isotérmica: aplicación de la ecuación de Gibbs-Duhem al estudio de la relación entre titulaciones directas e inversas". Journal of Solution Chemistry . 44 (5): 987–1003. doi :10.1007/s10953-014-0243-7. ISSN  0095-9782. S2CID  98752781.
10. Grossoehme, Nicholas E.; Spuches, Anne M.; Wilcox, Dean E. (2010). "Aplicación de calorimetría de titulación isotérmica en química bioinorgánica". Revista de química inorgánica biológica . 15 (8): 1183–91. doi :10.1007/s00775-010-0693-3. ISSN  0949-8257. PMID  20725755. S2CID  28672066.
11. Quinn, Colette F.; Carpenter, Margaret C.; Croteau, Molly L.; Wilcox, Dean E. (2016), "Medidas calorimétricas de titulación isotérmica de la unión de iones metálicos a proteínas", Calorimetry, Methods in Enzymology, vol. 567, Elsevier, págs. 3–21, doi :10.1016/bs.mie.2015.08.021, ISBN 978-0-12-802906-0, PMID  26794348 , consultado el 15 de febrero de 2023
12. Parrish, Wm.R. (1986). "Avances recientes en calorimetría". Fluid Phase Equilibria . 29 : 177–192. Bibcode :1986FlPEq..29..177P. doi :10.1016/0378-3812(86)85020-8.
13. Falconer, Robert J. (2016). "Aplicaciones de la calorimetría de titulación isotérmica: investigación y desarrollos técnicos de 2011 a 2015: Revisión de la calorimetría de titulación isotérmica de 2011 a 2015". Journal of Molecular Recognition . 29 (10): 504–515. doi :10.1002/jmr.2550. PMID  27221459. S2CID  206095685.
14. Falconer, Robert J.; Schuur, Boelo; Mittermaier, Anthony K. (2021). "Aplicaciones de la calorimetría de titulación isotérmica en la investigación pura y aplicada de 2016 a 2020". Revista de reconocimiento molecular . 34 (10): e2901. doi :10.1002/jmr.2901. ISSN  0952-3499. PMID  33975380. S2CID  234472084.
15. Wang, Yun; Wang, Guanyu; Moitessier, Nicolas; Mittermaier, Anthony K. (19 de octubre de 2020). "Cinética enzimática por calorimetría de titulación isotérmica: alosteria, inhibición y dinámica". Frontiers in Molecular Biosciences . 7 : 583826. doi : 10.3389/fmolb.2020.583826 . ISSN  2296-889X. PMC 7604385 . PMID  33195429. 
16. Burnouf, Dominique; Ennifar, Eric; Guedich, Sondes; Puffer, Barbara; Hoffmann, Guillaume; Bec, Guillaume; Disdier, François; Baltzinger, Mireille; Dumas, Philippe (11 de enero de 2012). "kinITC: Un nuevo método para obtener datos termodinámicos y cinéticos conjuntos mediante calorimetría de titulación isotérmica". Revista de la Sociedad Química Americana . 134 (1): 559–565. doi :10.1021/ja209057d. ISSN  0002-7863. PMID  22126339.
17. Draczkowski, Piotr; Matosiuk, Dariusz; Jozwiak, Krzysztof (2014). "Calorimetría de titulación isotérmica en la investigación de proteínas de membrana". Revista de análisis farmacéutico y biomédico . 87 : 313–325. doi :10.1016/j.jpba.2013.09.003. PMID  24119484.
18. Kabiri, M.; Unsworth, LD (2014). "Aplicación de calorimetría de titulación isotérmica para caracterizar parámetros termodinámicos de interacciones biomoleculares: estudios de casos de autoensamblaje de péptidos y adsorción de proteínas". Biomacromolecules . 15 (10): 3463–73. doi :10.1021/bm5004515. PMID  25131962.
19. Freire, Ernesto (2008). "¿La entalpía y la entropía distinguen a los primeros de su clase de los mejores?". Drug Discovery Today . 13 (19): 869–874. doi :10.1016/j.drudis.2008.07.005. PMC 2581116 . PMID  18703160. 
20. Werber, L.; Mastai, Y. (2018). "Calorimetría de titulación isotérmica para química quiral". Quiralidad . 30 (5): 619–631. doi :10.1002/chir.22842. PMID  29528520.
21. Lin, LN; Mason, AB; Woodworth, RC; Brandts, JF (1991). "Estudios calorimétricos de la unión de iones férricos a ovotransferrina e interacciones entre sitios de unión". Bioquímica . 30 (50): 11660–9. doi :10.1021/bi00114a008. PMID  1751486.
22. Faller, P.; Hureau, C.; Dorlet, P.; Hellwig, P.; Coppel, Y.; Collin, F.; Alies, B. (2012). "Métodos y técnicas para estudiar la química bioinorgánica de complejos metal-péptidos vinculados a enfermedades neurodegenerativas". Coordination Chemistry Reviews . 256 (19–20): 2381–96. doi :10.1016/j.ccr.2012.03.015.
23. Rodríguez-Estupiñán, P.; Miranda-Carvajal, I.; Campos, PC; Guerrero-Fajardo, CA; Giraldo, L.; Moreno-Piraján, JC (2022). "Materiales a base de grafeno: análisis mediante técnicas calorimétricas". Revista de Análisis Térmico y Calorimetría . 147 (17): 9301–51. doi :10.1007/s10973-022-11206-w.