En bioquímica , la biotinilación es el proceso de unión covalente de biotina a una proteína, ácido nucleico u otra molécula. La biotinilación es rápida, específica y es poco probable que altere la función natural de la molécula debido al pequeño tamaño de la biotina (PM = 244,31 g/mol). La biotina se une a la estreptavidina y a la avidina con una afinidad extremadamente alta, una velocidad de activación rápida y una alta especificidad, y estas interacciones se explotan en muchas áreas de la biotecnología para aislar moléculas biotiniladas de interés. La unión de la biotina a la estreptavidina y a la avidina es resistente a extremos de calor, pH y proteólisis, lo que hace posible la captura de moléculas biotiniladas en una amplia variedad de entornos. Además, se pueden conjugar múltiples moléculas de biotina a una proteína de interés, lo que permite la unión de múltiples moléculas de proteína estreptavidina , avidina o neutravidina y aumenta la sensibilidad de detección de la proteína de interés. Existe una gran cantidad de reactivos de biotinilación disponibles que aprovechan la amplia gama de métodos de marcaje posibles. Debido a la fuerte afinidad entre la biotina y la estreptavidina, la purificación de proteínas biotiniladas ha sido un enfoque ampliamente utilizado para identificar interacciones proteína-proteína y eventos postraduccionales como la ubiquitinación [1] en biología molecular.
Las proteínas pueden biotinilarse química o enzimáticamente. La biotinilación química utiliza varias químicas de conjugación para producir biotinilación no específica de aminas, carboxilatos, sulfhidrilos y carbohidratos (por ejemplo, el acoplamiento NHS da lugar a la biotinilación de cualquier amina primaria en la proteína). La biotinilación enzimática da como resultado la biotinilación de una lisina específica dentro de una cierta secuencia por una biotina ligasa bacteriana. [2] La mayoría de los reactivos de biotinilación química consisten en un grupo reactivo unido a través de un enlace a la cadena lateral de ácido valérico de la biotina. Como el bolsillo de unión de la biotina en avidina / estreptavidina está enterrado debajo de la superficie de la proteína, los reactivos de biotinilación que poseen un enlace más largo son deseables, ya que permiten que la molécula de biotina, una vez que se ha unido a su objetivo, sea más accesible a la proteína de unión avidina / estreptavidina / Neutravidina. Este enlazador también puede mediar la solubilidad de los reactivos de biotinilación; los enlazadores que incorporan poli(etilen)glicol (PEG) pueden hacer que los reactivos insolubles en agua sean solubles o aumentar la solubilidad de los reactivos de biotinilación que ya son solubles hasta cierto punto.
A diferencia de los métodos de biotinilación química, la biotinilación enzimática permite que la biotina se una exactamente a un residuo presente en la proteína. Esta reacción de biotinilación también puede completarse, lo que significa que el producto se genera con alta uniformidad y se puede unir a la estreptavidina en una orientación definida, por ejemplo, para los multímeros del MHC . La biotinilación enzimática se lleva a cabo con mayor frecuencia por la holoenzima sintetasa de biotina de E. coli , también conocida como biotina ligasa (BirA, P06709 ). [3] [4]
La forma más común de apuntar a una proteína de interés es fusionando la proteína en su extremo N, extremo C o en un bucle interno a un péptido de 15 aminoácidos (GLNDIFEAQKIEWHE), denominado AviTag o péptido aceptor (AP). [5] Una vez marcada, la proteína se incuba con BirA, lo que permite que se produzca la biotinilación en presencia de biotina y ATP. [5] La biotinilación enzimática se puede llevar a cabo in vitro, pero BirA también reacciona específicamente con su péptido diana dentro de células bacterianas y de mamíferos y en la superficie celular, mientras que otras proteínas celulares no se modifican. [6] [7] [8] La biotinilación enzimática también puede tener lugar in vivo , normalmente a través de la coexpresión de una proteína marcada con Avitag y BirA. [9]
El sustrato natural de BirA es la proteína transportadora de carboxilo de biotina (BCCP). Antes de que se descubrieran las etiquetas más pequeñas, era necesario fusionar una proteína a la BCCP completa para que fuera el objetivo. [10] Una proteína fusionada por BCCP puede ser reconocida por moléculas de biotina in vivo y unirse a ella. [11] Se han utilizado algunas otras etiquetas pequeñas antes de AviTag, pero AviTag es la más eficiente hasta ahora. [4]
Los objetivos más comunes para modificar las moléculas de proteínas son los grupos de aminas primarias que están presentes como aminas épsilon de la cadena lateral de lisina y aminas α N-terminales. Los reactivos de biotinilación reactivos con aminas se pueden dividir en dos grupos según su solubilidad en agua .
Los ésteres de N-hidroxisuccinimida (NHS) tienen poca solubilidad en soluciones acuosas . Para reacciones en solución acuosa, primero deben disolverse en un disolvente orgánico y luego diluirse en la mezcla de reacción acuosa . Los disolventes orgánicos más utilizados para este propósito son el dimetilsulfóxido (DMSO) y la dimetilformamida (DMF), que son compatibles con la mayoría de las proteínas en bajas concentraciones. [12] Debido a la hidrofobicidad de los ésteres de NHS, los reactivos de biotinilación de NHS también pueden difundirse a través de la membrana celular , lo que significa que biotinilarán los componentes internos y externos de una célula .
Los ésteres sulfo-NHS son más solubles en agua y deben disolverse en agua justo antes de su uso porque se hidrolizan fácilmente. La solubilidad en agua de los ésteres sulfo-NHS se debe a su grupo sulfonato en el anillo N-hidroxisuccinimida y elimina la necesidad de disolver el reactivo en un disolvente orgánico. Los ésteres sulfo-NHS de biotina también se pueden utilizar como reactivos de biotinilación de la superficie celular, porque no penetran la membrana celular .
Las reacciones químicas de los ésteres de NHS y sulfo-NHS son esencialmente idénticas, ya que ambos reaccionan espontáneamente con aminas para formar un enlace amida. Debido a que el objetivo del éster es una amina primaria desprotonada, la reacción se ve favorecida en condiciones básicas (por encima de pH 7). La hidrólisis del éster de NHS es una reacción competitiva importante y la velocidad de hidrólisis aumenta con el aumento del pH . Los ésteres de NHS y sulfo-NHS tienen una vida media de varias horas a pH 7, pero solo de unos pocos minutos a pH 9.
Existe cierta flexibilidad en las condiciones para la conjugación de ésteres de NHS con aminas primarias. Las temperaturas de incubación pueden variar de 4 a 37 °C, los valores de pH en la reacción varían de 7 a 9 y los tiempos de incubación varían de unos pocos minutos a 12 horas. Se deben evitar los tampones que contienen aminas (como Tris o glicina ), ya que compiten con la reacción.
Una alternativa a la biotinilación de aminas primarias es marcar los grupos sulfhidrilo con biotina. Debido a que los grupos sulfhidrilo libres son menos frecuentes en la mayoría de las proteínas en comparación con las aminas primarias, la biotinilación con sulfhidrilo es útil cuando las aminas primarias se encuentran en el dominio regulador de la proteína diana o cuando se requiere un nivel reducido de biotinilación. Los grupos reactivos con sulfhidrilo, como las maleimidas , los haloacetilos y los disulfuros de piridilo, requieren grupos sulfhidrilo libres para la conjugación; los enlaces disulfuro primero deben reducirse para liberar los grupos sulfhidrilo para la biotinilación. Si no hay grupos sulfhidrilo libres disponibles, las lisinas se pueden modificar con varios reactivos de tiolación ( reactivo de Traut , SAT(PEG4), SATA y SATP), lo que da como resultado la adición de un sulfhidrilo libre. La biotinilación de sulfhidrilo se realiza a un pH ligeramente más bajo (6,5-7,5) que el marcado con ésteres NHS.
Además de las proteínas completas, los péptidos biotinilados pueden sintetizarse introduciendo un residuo de cisteína (Cys) durante la síntesis en el extremo de la cadena de aminoácidos para obtener una biotinilación específica y orientada al sitio. Los nucleótidos también pueden biotinilarse mediante la incorporación de nucleótidos tiolados .
Los grupos carboxilo se encuentran en los extremos C-terminales de las proteínas y en las cadenas laterales de los aminoácidos glutamato y aspartato. Los reactivos de biotinilación que se dirigen a los grupos carboxilo no tienen una fracción reactiva al carboxilo per se, sino que dependen de un reticulante de carbodiimida como EDC para unir la amina primaria en los reactivos de biotinilación al grupo carboxilo en la proteína objetivo.
La biotinilación en los grupos carboxilo se produce a un pH de 4,5 a 5,5. Para evitar la reactividad cruzada del agente de reticulación con los componentes del tampón, los tampones no deben contener aminas primarias (p. ej., Tris , glicina ) ni carboxilos (p. ej., acetato , citrato ); el tampón MES es una opción ideal.
Las glicoproteínas se pueden biotinilar modificando los residuos de carbohidratos a aldehídos , que luego reaccionan con reactivos de biotinilación basados en hidrazina o alcoxiamina. El peryodato de sodio oxida los ácidos siálicos de las glicoproteínas a aldehídos para formar estos enlaces estables a un pH de 4 a 6.
Los anticuerpos policlonales están fuertemente glicosilados y debido a que la glicosilación no interfiere con la actividad del anticuerpo, la biotinilación de los grupos glicosilados es una estrategia ideal para generar anticuerpos biotinilados.
Los oligonucleótidos se biotinilan fácilmente en el curso de la síntesis de oligonucleótidos mediante el método de fosforamidita utilizando fosforamidita de biotina comercial. [13] Tras la desprotección estándar, los conjugados obtenidos se pueden purificar mediante HPLC de fase inversa o de intercambio aniónico.
Los reactivos de biotinilación fotoactivables son ideales cuando no se dispone de aminas primarias, sulfhidrilos, carboxilos y carbohidratos para el marcaje. Estos reactivos se basan en azidas de arilo, que se activan con luz ultravioleta (UV; >350 nm), y luego reaccionan en los enlaces CH y NH. Debido a que estos tipos de enlaces se producen independientemente del tipo de aminoácido, este tipo de biotinilación se denomina "no específica".
Los reactivos de biotinilación fotoactivables también se pueden utilizar para activar la biotinilación en momentos específicos de un experimento o durante ciertas condiciones de reacción, simplemente exponiendo la reacción a la luz UV en el momento o condición específicos.
La etiqueta de biotina se puede utilizar en cromatografía de afinidad junto con una columna que tenga avidina (o estreptavidina o neutravidina ) unida a ella, que es el ligando natural de la biotina. Sin embargo, se necesitan condiciones duras (por ejemplo, 6 M GuHCl a pH 1,5) para romper la interacción avidina/estreptavidina-biotina, lo que muy probablemente desnaturalizará la proteína que lleva la etiqueta de biotina. Si se necesita aislar la proteína etiquetada, es mejor etiquetar la proteína con iminobiotina. Este análogo de biotina proporciona una fuerte unión a la avidina/estreptavidina a pH alcalino, pero la afinidad se reduce al reducir el pH. Por lo tanto, una proteína funcional etiquetada con iminobiotina se puede liberar de una columna de avidina/estreptavidina disminuyendo el pH (a alrededor de pH 4). [14] [15]
Esta etiqueta también se puede utilizar en la detección de la proteína a través de anticuerpos anti-biotina o estrategias de detección marcadas con avidina/estreptavidina como reporteros enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante , fosfatasa alcalina ) o sondas fluorescentes . Esto puede ser útil en la localización por microscopía fluorescente o electrónica, [16] ensayos ELISA , ensayos ELISPOT , transferencia Western y otros métodos inmunoanalíticos. La detección con estreptavidina monovalente puede evitar la agrupación o agregación del objetivo biotinilado. [17]
El enlace no covalente formado entre la biotina y la avidina o la estreptavidina tiene una afinidad de unión que es mayor que la mayoría de los enlaces de antígenos y anticuerpos y se acerca a la fuerza de un enlace covalente . Esta unión muy fuerte hace que el marcado de proteínas con biotina sea una herramienta útil para aplicaciones como la cromatografía de afinidad utilizando avidina o estreptavidina inmovilizada para separar la proteína biotinilada de una mezcla de otras proteínas y sustancias bioquímicas. La proteína biotinilada, como la albúmina sérica bovina biotinilada (BSA), se utiliza en ensayos en fase sólida como un recubrimiento en la superficie de los pocillos en placas de ensayo de múltiples pocillos. La biotinilación de glóbulos rojos se ha utilizado como un medio para determinar el volumen sanguíneo total sin el uso de radiomarcadores como el cromo 51, lo que permite determinaciones de volumen en bebés de bajo peso al nacer y mujeres embarazadas que de otro modo no podrían estar expuestas a las dosis requeridas de radiactividad. Además, la biotinilación de moléculas MHC para crear multímeros MHC se ha convertido en una herramienta útil para identificar y aislar poblaciones de células T específicas de antígenos . Más recientemente, se desarrolló la biotinilación de proteínas in vivo para estudiar las interacciones proteína-proteína y la proximidad en células vivas [18] [19] [20]
Las condiciones de reacción para la biotinilación se eligen de modo que la molécula objetivo (por ejemplo, un anticuerpo) esté marcada con suficientes moléculas de biotina para purificar o detectar la molécula, pero no tanto como para que la biotina interfiera con la función de la molécula.
El ensayo HABA (ácido 2-(4-hidroxiazobenceno) benzoico) se puede utilizar para determinar el grado de biotinilación. El colorante HABA se une a la avidina o la estreptavidina y produce una absorbancia característica. Cuando se introducen proteínas biotiniladas u otras moléculas, la biotina desplaza al colorante, lo que produce un cambio en la absorbancia a 500 nm. Este cambio es directamente proporcional al nivel de biotina en la muestra. La desventaja del ensayo HABA es que utiliza grandes cantidades de muestra.
El grado de biotinilación también se puede medir mediante el desplazamiento en gel de estreptavidina, ya que la estreptavidina permanece unida a la biotina durante la electroforesis en gel de agarosa o la electroforesis en gel de poliacrilamida . La proporción de la diana biotinilada se puede medir mediante el cambio en la intensidad de la banda de la diana con o sin exceso de estreptavidina, que se observa de forma rápida y cuantitativa para las proteínas biotiniladas mediante tinción con azul brillante de Coomassie . [21]