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Las partes de BioBrick son secuencias de ADN que se ajustan a un estándar de ensamblaje de enzimas de restricción . [1] [2] Estos bloques de construcción se utilizan para diseñar y ensamblar circuitos biológicos sintéticos más grandes a partir de partes individuales y combinaciones de partes con funciones definidas, que luego se incorporarían a células vivas como las células de Escherichia coli para construir nuevos sistemas biológicos. [3] Los ejemplos de partes de BioBrick incluyen promotores , sitios de unión ribosómica (RBS) , secuencias codificantes y terminadores .
Las piezas BioBrick se utilizan aplicando principios de ingeniería de abstracción y modularización. Las piezas BioBrick forman la base del sistema jerárquico en el que se basa la biología sintética . La jerarquía consta de tres niveles:
El desarrollo de componentes biológicos estandarizados permite el ensamblaje rápido de secuencias. La capacidad de probar componentes y dispositivos individuales para que se puedan probar y caracterizar de forma independiente también mejora la confiabilidad de los sistemas de orden superior. [2]
El primer intento de crear una lista de partes biológicas estándar fue en 1996, por Rebatchouk et al . Este equipo introdujo una estrategia de clonación para el ensamblaje de fragmentos cortos de ADN. Sin embargo, este intento temprano no fue ampliamente reconocido por la comunidad de investigación científica en ese momento. [2] [4] En 1999, Arkin y Endy se dieron cuenta de que los elementos heterogéneos que componían un circuito genético carecían de estándares, por lo que propusieron una lista de partes biológicas estándar. [5] Los BioBricks fueron descritos e introducidos por Tom Knight en el MIT en 2003. [1] Desde entonces, varios grupos de investigación han utilizado las partes estándar de BioBrick para diseñar nuevos dispositivos y sistemas biológicos.
La Fundación BioBricks fue fundada en 2006 por ingenieros y científicos como una organización sin fines de lucro para estandarizar partes biológicas en todo el campo. [6] La Fundación se centra en mejorar en áreas de tecnología, derecho, educación y la comunidad global en lo que respecta a la biología sintética . Las actividades de la Fundación BioBricks incluyen la celebración de conferencias SBx.0 y programas técnicos y educativos. Las conferencias SBx.0 son conferencias internacionales sobre biología sintética que se celebran en todo el mundo. Los programas técnicos están destinados a la producción de una serie de partes biológicas estándar, y su expansión educativa está creando actos que ayudan a crear fuentes abiertas y estandarizadas de partes biológicas. [7]
Como alternativa a los sistemas tradicionales de patentes de biotecnología y en un esfuerzo por permitir que BioBricks se utilice como un estándar comunitario de código abierto, la Fundación BioBricks creó el Acuerdo Público BioBrick, que consta de un Acuerdo de Colaboración y un Acuerdo de Usuario. Aquellos que quieran dar una parte a la comunidad firman el Acuerdo de Colaboración, acordando no hacer valer contra los Usuarios derechos de propiedad intelectual de los Colaboradores que puedan limitar el uso de los materiales aportados. Los firmantes del Acuerdo de Usuario pueden utilizar libremente toda la colección de partes proporcionadas por los colaboradores. No existe ningún requisito para que los usuarios contribuyan a la comunidad para utilizar las partes, y los usuarios pueden hacer valer derechos de propiedad intelectual sobre las invenciones desarrolladas mediante el uso de las partes. [8] El Acuerdo de Usuario permite a los usuarios establecer la invención de usos de las partes, divulgar patentes sobre combinaciones de partes y desarrollar libremente las contribuciones de otros usuarios. [9] [10]
El estándar de ensamblaje BioBrick se introdujo para superar la falta de estandarización que planteaban los métodos tradicionales de clonación molecular . El estándar de ensamblaje BioBrick es un enfoque más confiable para combinar piezas para formar compuestos más grandes. El estándar de ensamblaje permite que dos grupos de biólogos sintéticos en diferentes partes del mundo reutilicen una pieza BioBrick sin pasar por todo el ciclo de diseño y manipulación. [2] Esto significa que la pieza recién diseñada puede ser utilizada por otros equipos de investigadores con mayor facilidad. Además de eso, en comparación con el antiguo método de clonación ad hoc , el proceso del estándar de ensamblaje es más rápido y promueve la automatización. [11] El estándar de ensamblaje BioBrick 10 fue el primer estándar de ensamblaje que se introdujo. A lo largo de los años, se han desarrollado varios otros estándares de ensamblaje, como el estándar Biofusion y el estándar Freiburg.
El estándar de ensamblaje 10 fue desarrollado por Tom Knight y es el estándar de ensamblaje más utilizado. Implica el uso de enzimas de restricción . Cada parte de BioBrick es una secuencia de ADN que es transportada por un plásmido circular , que actúa como un vector . [12] El vector actúa como un sistema de transporte para transportar las partes de BioBrick. El primer enfoque hacia un estándar BioBrick fue la introducción de secuencias estándar, las secuencias de prefijo y sufijo, que flanquean los extremos 5 ' y 3 ' de la parte de ADN respectivamente. [13] Estas secuencias estándar codifican sitios de enzimas de restricción específicos. La secuencia de prefijo codifica sitios EcoRI (E) y Xbal (X), mientras que la secuencia de sufijo codifica sitios SpeI (S) y PstI (P). El prefijo y el sufijo no se consideran parte de la parte BioBrick. [3] Para facilitar el proceso de ensamblaje, la parte BioBrick en sí no debe contener ninguno de estos sitios de restricción. Durante el ensamblaje de dos partes diferentes, uno de los plásmidos se digiere con EcoRI y SpeI . El plásmido que lleva la otra parte de BioBrick se digiere con EcoRI y Xbal . Esto deja a ambos plásmidos con 4 pares de bases (pb) salientes en los extremos 5 ' y 3 ' . Los sitios EcoRI se ligarán ya que son complementarios entre sí. Los sitios Xbal y SpeI también se ligarán ya que la digestión produce extremos compatibles. Ahora, ambas partes de ADN están en un plásmido. La ligación produce un sitio de "cicatriz" de 8 pares de bases entre las dos partes de BioBrick. Dado que el sitio de cicatriz es un híbrido de los sitios Xbal y SpeI , no es reconocido por ninguna de las enzimas de restricción. [13] Las secuencias de prefijo y sufijo permanecen sin cambios por este proceso de digestión y ligadura, lo que permite pasos de ensamblaje posteriores con más partes de BioBrick.
Este ensamblaje es un proceso idempotente : múltiples aplicaciones no cambian el producto final y mantienen el prefijo y el sufijo. Aunque el ensamblaje estándar de BioBrick permite la formación de módulos funcionales, existe una limitación para este enfoque estándar de 10. El sitio de cicatriz de 8 pb no permite la creación de una proteína de fusión . [12] El sitio de cicatriz provoca un cambio de marco que impide la lectura continua de codones, que es necesaria para la formación de la proteína de fusión.
Tom Knight desarrolló posteriormente en 2008 el estándar de ensamblaje BB-2 para abordar los problemas con la unión de las cicatrices de los dominios proteicos y que las cicatrices constan de ocho bases, lo que producirá un marco de lectura alterado al unir dominios proteicos. Las enzimas utilizadas para la digestión de las partes iniciales son casi las mismas, pero con prefijos y sufijos modificados. [14]
El estándar de ensamblaje BglBrick fue propuesto por J. Christopher Anderson, John E. Dueber, Mariana Leguia, Gabriel C. Wu, Jonathan C. Goler, Adam P. Arkin y Jay D. Keasling en septiembre de 2009 como un estándar muy similar en concepto a BioBrick, pero que permite la generación de proteínas de fusión sin alterar el marco de lectura o introducir codones de parada y al mismo tiempo crear una cicatriz de enlace de aminoácidos relativamente neutral (GlySer). Una parte de BglBrick es como una secuencia de ADN flanqueada por sitios EcoRI y BglII de 5 ′ (GAATTCaaaA GATCT ) y sitios BamHI y XhoI de 3 ′ ( G GATCCaaaCTCGAG), y carece de estos mismos sitios de restricción internamente. La parte ascendente en el ensamblaje por pares se purifica a partir de una digestión EcoRI/BamHI, y la parte descendente + vector se purifica a partir de una digestión EcoRI/BglII. La ligadura de estos dos fragmentos crea una parte compuesta que reforma los sitios flanqueantes originales requeridos en la definición de la parte y deja una secuencia de cicatriz GGATCT en la unión de las partes, una cicatriz que codifica los aminoácidos glicina y serina cuando se fusionan las partes de CDS en el marco, lo que es conveniente debido a que el dipéptido GlySer es un enlazador popular de dominios proteicos. [2]
El laboratorio de Pam Silver creó el estándar de ensamblaje Silver para superar el problema relacionado con la formación de la proteína de fusión. Este estándar de ensamblaje también se conoce como estándar Biofusion y es una mejora del estándar de ensamblaje BioBrick 10. El estándar de Silver implica la eliminación de un nucleótido del sitio Xbal y SpeI , lo que acorta el sitio de cicatrización en 2 nucleótidos, que ahora forma una secuencia de cicatrización de 6 pb. La secuencia de 6 pb permite que se mantenga el marco de lectura. La secuencia de cicatrización codifica el aminoácido treonina (ACT) y la arginina (AGA). [15] Esta pequeña mejora permite la formación de la proteína de fusión en marco. Sin embargo, el hecho de que la arginina sea un aminoácido grande y cargado es una desventaja para la técnica de ensamblaje Biofusion: estas propiedades de la arginina dan como resultado la desestabilización de la proteína por la regla del extremo N.
El equipo iGEM de Friburgo de 2007 [16] introdujo un nuevo estándar de ensamblaje para superar las desventajas de la técnica estándar Biofusion existente. El equipo de Friburgo creó un nuevo conjunto de secuencias de prefijo y sufijo introduciendo sitios de enzimas de restricción adicionales, AgeI y NgoMIV, al prefijo y sufijo existentes respectivamente. Estos sitios de enzimas de restricción recientemente introducidos son compatibles con el estándar BioBrick. El estándar de Friburgo todavía forma un sitio de cicatriz de 6 pb, pero la secuencia de cicatriz (ACCGGC) ahora codifica treonina y glicina respectivamente. Esta secuencia de cicatriz da como resultado una proteína mucho más estable [17] ya que la glicina forma un extremo N-terminal estable, a diferencia de la arginina, que indica la degradación del extremo N-terminal. La técnica de ensamblaje propuesta por el equipo de Friburgo disminuye las limitaciones del estándar Biofusion.
Se utilizan distintos métodos para ensamblar BioBricks. Esto se debe a que algunas normas requieren materiales y métodos diferentes (uso de diferentes enzimas de restricción), mientras que otras se deben a preferencias en el protocolo porque algunos métodos de ensamblaje tienen mayor eficiencia y son más fáciles de usar.
El método de ensamblaje 3A es el más utilizado, ya que es compatible con el estándar de ensamblaje 10, el estándar Silver y el estándar de Friburgo. Este método de ensamblaje implica dos partes de BioBrick y un plásmido de destino. El plásmido de destino contiene un gen tóxico (letal) para facilitar la selección de un plásmido correctamente ensamblado. Los plásmidos de destino también tienen genes de resistencia a antibióticos diferentes a los plásmidos que llevan las partes de BioBrick. Los tres plásmidos se digieren con una enzima de restricción adecuada y luego se dejan ligar. Solo la parte correctamente ensamblada producirá una parte compuesta viable contenida en el plásmido de destino. Esto permite una buena selección, ya que solo las partes de BioBrick correctamente ensambladas sobreviven.
El método de ensamblaje de insertos amplificados no depende de secuencias de prefijo y sufijo, lo que permite su uso en combinación con la mayoría de los estándares de ensamblaje. También tiene una tasa de transformación más alta que el ensamblaje 3A y no requiere que los plásmidos involucrados tengan diferentes genes de resistencia a antibióticos. Este método reduce el ruido de los plásmidos sin cortar al amplificar un inserto deseado mediante PCR antes de la digestión y tratar la mezcla con la enzima de restricción DpnI, que digiere el ADN metilado como los plásmidos. La eliminación de los plásmidos molde con DpnI deja solo el inserto para ser amplificado por PCR. Para disminuir la posibilidad de crear plásmidos con combinaciones no deseadas de inserto y estructura principal, la estructura principal puede tratarse con fosfatasa para evitar su religación. [14]
El método de ensamblaje sin cicatrices de Gibson permite la unión de múltiples BioBricks simultáneamente. Este método requiere que las secuencias deseadas tengan una superposición de 20 a 150 bps . Debido a que los BioBricks no tienen esta superposición, este método requiere cebadores de PCR para crear salientes entre BioBricks adyacentes. La exonucleasa T5 ataca los extremos 5 ' de las secuencias, creando ADN monocatenario en los extremos de todas las secuencias donde los diferentes componentes están diseñados para anexarse. Luego, la ADN polimerasa agrega partes de ADN a los espacios en los componentes anexados, y una Taq ligasa puede sellar las hebras finales. [14]
El método de ensamblaje 4R/2M fue diseñado para combinar partes (BioBrick Assembly Standard 10 o Silver Standard) dentro de plásmidos existentes (es decir, sin PCR ni subclonación). Los plásmidos se hacen reaccionar in vivo con metiltransferasas de ADN específicas de la secuencia, de modo que cada uno se modifica y se protege de una de las dos endonucleasas de restricción que luego se utilizan para linealizar productos de ligadura circular no deseados. [18]
El grupo del MIT dirigido por Tom Knight que desarrolló BioBricks y la competencia International Genetically Engineered Machines (iGEM) también es pionero en el Registro de Partes Biológicas Estándar (Registry). [19] El Registro, que es uno de los fundamentos de la biología sintética, proporciona información y datos basados en la web sobre más de 20.000 partes de BioBrick. El Registro contiene:
Cada pieza de BioBrick tiene su código de identificación único que facilita la búsqueda de la pieza de BioBrick deseada (por ejemplo, BBa_J23100, un promotor constitutivo). [2] El registro es de acceso abierto, por lo que cualquier persona puede enviar una pieza de BioBrick. La mayoría de las presentaciones de BioBrick provienen de estudiantes que participan en la competencia anual iGEM que se realiza cada verano. [20] El registro permite el intercambio de datos y materiales en línea, lo que permite una rápida reutilización y modificación de las piezas por parte de la comunidad participante.
También se han desarrollado registros de piezas profesionales. Dado que la mayoría de las piezas BioBrick son presentadas por estudiantes universitarios como parte de la competencia iGEM, las piezas pueden carecer de datos de caracterización y metadatos importantes que serían esenciales a la hora de diseñar y modelar los componentes funcionales. [19] Un ejemplo de un registro de piezas profesionales es la instalación financiada con fondos públicos con sede en EE. UU., The International Open Facility Advancing Biotechnology (BIOFAB), que contiene descripciones detalladas de cada pieza biológica. También es un registro de código abierto y está disponible comercialmente. BIOFAB tiene como objetivo catalogar piezas BioBrick de alta calidad para satisfacer las necesidades de la comunidad de biología sintética profesional.
La Fundación BioBrick (BBF) es una organización de beneficio público creada para promover el uso de piezas BioBrick estandarizadas en una escala que supere la competencia de iGEM. La BBF está trabajando actualmente en la derivación de un marco estándar para promover la producción de piezas BioBrick de alta calidad que estarían disponibles gratuitamente para todos. [21]
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