Una biblioteca de ADNc es una combinación de fragmentos de ADNc clonados ( ADN complementario ) insertados en una colección de células huésped, que constituyen una parte del transcriptoma del organismo y se almacenan como una " biblioteca ". El ADNc se produce a partir del ARNm completamente transcrito que se encuentra en el núcleo y, por lo tanto, contiene solo los genes expresados de un organismo. De manera similar, se pueden producir bibliotecas de ADNc específicas de tejido. En las células eucariotas, el ARNm maduro ya está empalmado , por lo tanto, el ADNc producido carece de intrones y se puede expresar fácilmente en una célula bacteriana. Si bien la información en las bibliotecas de ADNc es una herramienta poderosa y útil ya que los productos genéticos se identifican fácilmente, las bibliotecas carecen de información sobre potenciadores , intrones y otros elementos reguladores que se encuentran en una biblioteca de ADN genómico . [1] [2]
El ADNc se crea a partir de un ARNm maduro de una célula eucariota mediante el uso de la transcriptasa inversa . En los eucariotas, una cola de poli-(A) (que consiste en una secuencia larga de nucleótidos de adenina) distingue el ARNm del ARNt y el ARNr y, por lo tanto, se puede utilizar como sitio de cebador para la transcripción inversa. Esto tiene el problema de que no todas las transcripciones, como las de la histona , codifican una cola de poli-A . [3] [4]
En primer lugar, es necesario aislar la plantilla de ARNm para la creación de bibliotecas de ADNc. Dado que el ARNm solo contiene exones, se debe considerar la integridad del ARNm aislado para que la proteína codificada aún pueda producirse. El ARNm aislado debe tener entre 500 pb y 8 kb. [5] Existen varios métodos para purificar el ARN, como la extracción con trizol y la purificación en columna . La purificación en columna se puede realizar utilizando resinas recubiertas de nucleótidos dT oligoméricos, y se pueden aprovechar las características del ARNm, como tener una cola de poli-A, donde solo se unirán las secuencias de ARNm que contienen dicha característica. Luego se eluye el ARNm deseado unido a la columna .
Una vez que se purifica el ARNm, se une un cebador oligo-dT (una secuencia corta de nucleótidos de desoxi-timidina) a la cola poli-A del ARN. El cebador es necesario para iniciar la síntesis de ADN por la enzima transcriptasa inversa . Esto da como resultado la creación de híbridos ARN-ADN donde una sola hebra de ADN complementario está unida a una hebra de ARNm. [6] Para eliminar el ARNm, se utiliza la enzima ARNasa H para escindir la estructura principal del ARNm y generar grupos 3'-OH libres, lo que es importante para la sustitución del ARNm por ADN. [5] Luego se agrega la ADN polimerasa I, el ARN escindido actúa como un cebador que la ADN polimerasa I puede identificar e iniciar la sustitución de los nucleótidos del ARN por los del ADN. [5] Esto lo proporciona el propio sscADN al enrollarse sobre sí mismo en el extremo 3', generando un bucle de horquilla . La polimerasa extiende el extremo 3'-OH y, posteriormente , el bucle en el extremo 3' se abre mediante la acción de tijera de la nucleasa S 1. A continuación, se utilizan endonucleasas de restricción y ADN ligasa para clonar las secuencias en plásmidos bacterianos .
Las bacterias clonadas se seleccionan luego, generalmente mediante el uso de selección con antibióticos. Una vez seleccionadas, se crean reservas de bacterias que luego se pueden cultivar y secuenciar para compilar la biblioteca de ADNc.
Las bibliotecas de ADNc se utilizan comúnmente para reproducir genomas eucariotas, ya que la cantidad de información se reduce para eliminar la gran cantidad de regiones no codificantes de la biblioteca. Las bibliotecas de ADNc se utilizan para expresar genes eucariotas en procariotas. Los procariotas no tienen intrones en su ADN y, por lo tanto, no poseen ninguna enzima que pueda cortarlo durante el proceso de transcripción. El ADNc no tiene intrones y, por lo tanto, se puede expresar en células procariotas. Las bibliotecas de ADNc son más útiles en genética inversa , donde la información genómica adicional es de menor utilidad. Además, las bibliotecas de ADNc se utilizan con frecuencia en la clonación funcional para identificar genes según la función de la proteína codificada. Al estudiar el ADN eucariota, se construyen bibliotecas de expresión utilizando ADN complementario (ADNc) para ayudar a garantizar que el inserto sea realmente un gen. [6]
La biblioteca de ADNc carece de los elementos no codificantes y reguladores que se encuentran en el ADN genómico. Las bibliotecas de ADN genómico proporcionan información más detallada sobre el organismo, pero su generación y mantenimiento requieren más recursos.
Las moléculas de ADNc se pueden clonar utilizando enlaces de sitios de restricción. Los enlaces son fragmentos cortos de ADN de doble cadena ( oligodesoxirribonucleótido ) de aproximadamente 8 a 12 pares de nucleótidos de longitud que incluyen un sitio de escisión de endonucleasa de restricción, p. ej. BamHI. Tanto el ADNc como el enlace tienen extremos romos que se pueden ligar entre sí utilizando una alta concentración de ADN ligasa T4. Luego se producen extremos pegajosos en la molécula de ADNc al escindir los extremos del ADNc (que ahora tienen enlaces con un sitio incorporado) con la endonucleasa adecuada. Luego también se escinde un vector de clonación ( plásmido ) con la endonucleasa adecuada. Después de la ligadura de " extremos pegajosos " del inserto en el vector, la molécula de ADN recombinante resultante se transfiere a la célula huésped de E. coli para la clonación.
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