La fragmentación del ADN apoptótico es una característica clave de la apoptosis , un tipo de muerte celular programada . La apoptosis se caracteriza por la activación de endonucleasas endógenas , en particular la ADNasa activada por caspasa-3 (CAD), [1] con la escisión posterior del ADN nuclear en fragmentos internucleosomales de aproximadamente 180 pares de bases (pb) y múltiplos de los mismos (360, 540, etc.). La fragmentación del ADN apoptótico se está utilizando como un marcador de apoptosis y para la identificación de células apoptóticas ya sea a través del ensayo de encadenamiento de ADN , [2] el ensayo TUNEL , [3] [4] o mediante la detección de células con contenido de ADN fraccional ("células sub G 1 ") en histogramas de frecuencia de contenido de ADN, por ejemplo, como en el ensayo de Nicoletti . [5] [6]
La enzima responsable de la fragmentación del ADN apoptótico es la caspasa - D Nasa activada (CAD) . La CAD normalmente es inhibida por otra proteína, el inhibidor de la caspasa - D Nasa activada (ICAD) . Durante la apoptosis, la caspasa efectora apoptótica, caspasa-3 , escinde la ICAD y, por lo tanto, hace que la CAD se active. [7]
La CAD corta el ADN en los sitios de unión internucleosomales entre los nucleosomas , estructuras que contienen proteínas y que se encuentran en la cromatina a intervalos de ~180 pb. Esto se debe a que el ADN normalmente está firmemente envuelto alrededor de las histonas , las proteínas centrales de los nucleosomas. Los sitios de unión son las únicas partes de la cadena de ADN que están expuestas y, por lo tanto, accesibles a la CAD.
La degradación del ADN nuclear en unidades nucleosomales es una de las características de la muerte celular apoptótica. Se produce en respuesta a diversos estímulos apoptóticos en una amplia variedad de tipos de células. La caracterización molecular de este proceso identificó una DNasa específica (CAD, DNasa activada por caspasa) que escinde el ADN cromosómico de una manera dependiente de la caspasa. La CAD se sintetiza con la ayuda de ICAD (inhibidor de CAD), que funciona como una chaperona específica para CAD y se encuentra en complejo con ICAD en células proliferantes. Cuando se induce a las células a sufrir apoptosis, la caspasa 3 escinde ICAD para disociar el complejo CAD:ICAD, lo que permite que CAD escinda el ADN cromosómico. Las células que carecen de ICAD o que expresan ICAD mutante resistente a la caspasa no muestran fragmentación del ADN durante la apoptosis, aunque sí presentan algunas otras características de la apoptosis y mueren.
Aunque se ha trabajado mucho en el análisis de los eventos apoptóticos, hay poca información disponible que vincule el momento en que se producen las características morfológicas en la superficie celular y en el núcleo con la degradación bioquímica del ADN en las mismas células. La apoptosis puede iniciarse por una gran variedad de mecanismos diferentes en diferentes tipos de células, y la cinética de estos eventos varía ampliamente, desde unos pocos minutos hasta varios días, según el sistema celular. La presencia o ausencia de un evento apoptótico particular, incluida la fragmentación del ADN, depende de la "ventana de tiempo" en la que se investiga el proceso cinético de la apoptosis. A menudo, esto puede complicar la identificación de células apoptóticas si las poblaciones celulares se analizan solo en un único momento temporal, por ejemplo, después de la inducción de la apoptosis.
El descubrimiento de la fragmentación internucleosomal del ADN genómico en fragmentos oligonucleosomales repetitivos regulares generados por la endonucleasa dependiente de Ca/Mg se acepta como uno de los marcadores bioquímicos mejor caracterizados de la apoptosis (muerte celular programada).
En 1970, Williamson describió que el ADN citoplasmático aislado de células de hígado de ratón después del cultivo se caracterizaba por fragmentos de ADN con un peso molecular que consistía en múltiplos de 135 kDa . Este hallazgo era consistente con la hipótesis de que estos fragmentos de ADN eran un producto de degradación específico del ADN nuclear. [8] En 1972, Kerr , Wyllie y Currie acuñaron el término apoptosis y distinguieron este tipo de muerte celular de la necrosis basándose en características morfológicas. [9] En 1973, Hewish y Burgoyne , durante el estudio de la estructura de la subcromatina, encontraron que la cromatina es accesible a la endonucleasa Ca ++ /Mg ++ , lo que resulta en la formación de un producto de digestión con una serie regular de peso molecular similar al descrito previamente por Williamson (1970). [10] En 1974, Williams , Little y Shipley , utilizando células expuestas a diferentes tipos de trauma, encontraron que durante la muerte celular, el ADN degradado en "cada caso tenía un valor modal de entre 10(x6) y 10(x7) Dalton y se requiere metabolismo celular para producir degradación del ADN". Sin embargo, esta observación no indicaba "si el ataque de incisión en la molécula de ADN era aleatorio o más bien en un sitio particular, que tuviera un significado estructural o funcional". [11] En 1976, Scalka , Matyasova y Cejkova describieron la fragmentación internucleosomal del ADN de cromatina linfoide irradiado in vivo . [12]
Pasaron seis años desde 1972 a 1978/1980 hasta el descubrimiento y evaluación de la fragmentación internucleosomal del ADN durante la muerte celular apoptótica como un sello distintivo de la apoptosis. Desde 1972 ( Kerr , Wyllie y Currie [9] ), se acepta que la muerte de linfocitos inducida por glucocorticoides es una forma de apoptosis. En 1978, Zakharyan y Pogosyan presentaron un artículo que revelaba que la degradación del ADN inducida por glucocorticoides en el tejido linfoide de ratas, el timo y el bazo se producía en un patrón específico produciendo fragmentos de ADN que eran electroforéticamente similares a los observados después del tratamiento de la cromatina con nucleasa microcócica, lo que indicaba que el patrón de escisión internucleosomal de la degradación del ADN se producía durante la apoptosis. [13] [14] De esta forma, se descubrió el primer vínculo entre la muerte celular programada/apoptosis y la fragmentación internucleosomal del ADN de la cromatina, y pronto se convirtió en una característica específica de la apoptosis.
En 1980, Wyllie informó evidencia adicional de un patrón de escisión de ADN internucleosómico como una característica específica de los timocitos tratados con glucocorticoides que experimentan apoptosis. [2] El patrón de escisión de ADN internucleosómico se observó como una característica específica de la apoptosis en 1978/1980 y se ha convertido en un sello distintivo reconocido de la muerte celular programada desde entonces. En 1992, Gorczyca et al. [3] y Gavrieli et al. [4] describieron de forma independiente el ensayo de fragmentación de ADN basado en el uso de la desoxinucleotidil transferasa terminal ( TUNEL ), que se convirtió en uno de los métodos estándar para detectar e identificar células apoptóticas.
La citometría de flujo se utiliza con mayor frecuencia para detectar la fragmentación del ADN apoptótico. [15] El análisis del contenido de ADN por citometría de flujo puede identificar células apoptóticas con ADN fragmentado como las células con contenido fraccional de ADN, a menudo llamadas células sub-G 1. El ensayo de citometría de flujo que utiliza el fluorocromo naranja de acridina muestra que la fragmentación del ADN dentro de las células individuales es discontinua, probablemente reflejando diferentes niveles de restricción en la accesibilidad del ADN a la DNasa, por los niveles supranucleosomal y nucleosomal de la estructura de la cromatina. [16] La presencia de "células sub-G 1 " apoptóticas también se puede detectar en células prefijadas en etanol pero no después de la fijación en los fijadores de reticulación como el formaldehído . Las células apoptóticas tardías S y G 2 pueden no detectarse con este enfoque porque su contenido fraccional de ADN puede superponerse con el de las células G 1 no apoptóticas . [17] El tratamiento de células con detergente, antes o simultáneamente con el fluorocromo de ADN, también revela fragmentación del ADN en virtud de la presencia de células sub-G 1 o fragmentos de células, como lo definen Nicoletti et al. [5]
La fragmentación apoptótica del ADN también se puede detectar mediante el ensayo TUNEL . El ensayo TUNEL basado en fluorocromo aplicable para citometría de flujo correlaciona la detección de roturas de cadenas de ADN con el contenido de ADN celular y, por lo tanto, con la posición de la fase del ciclo celular . El ensayo TUNEL de marcaje con avidina-peroxidasa es aplicable para microscopía de absorción de luz. Muchos kits relacionados con TUNEL están disponibles comercialmente. La fragmentación apoptótica del ADN también se analiza utilizando electroforesis en gel de agarosa para demostrar un patrón de "escalera" a intervalos de ~180 BP . [1] La necrosis , por otro lado, generalmente se caracteriza por una fragmentación aleatoria del ADN que forma una "mancha" en los geles de agarosa.
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