La desactivación de genes es una técnica experimental mediante la cual se reduce la expresión de uno o más genes de un organismo . La reducción puede ocurrir mediante modificación genética o mediante el tratamiento con un reactivo como un oligonucleótido corto de ADN o ARN que tenga una secuencia complementaria a cualquiera de los genes o a una transcripción de ARNm. [1]
Si se modifica genéticamente el ADN de un organismo, el organismo resultante se denomina "organismo knockdown". Si el cambio en la expresión génica es causado por la unión de un oligonucleótido a un ARNm o la unión temporal a un gen , esto conduce a un cambio temporal en la expresión génica que no modifica el ADN cromosómico y el resultado se denomina "knockdown transitorio". [1]
En un knockdown transitorio, la unión de este oligonucleótido al gen activo o sus transcripciones provoca una disminución de la expresión a través de una variedad de procesos. La unión puede ocurrir ya sea a través del bloqueo de la transcripción (en el caso de la unión génica), la degradación de la transcripción del ARNm (por ejemplo, por ARN interferente pequeño ( siRNA )) o antisentido dependiente de la ARNasa -H, o a través del bloqueo de la traducción del ARNm , sitios de empalme del ARN pre-m o sitios de escisión de nucleasa utilizados para la maduración de otros ARN funcionales, incluido el miRNA (por ejemplo, por oligos morfolino u otros antisentido independientes de la ARNasa-H). [1] [2]
El uso más directo de los knockdowns transitorios es para aprender sobre un gen que ha sido secuenciado , pero que tiene una función desconocida o no se conoce por completo. Este enfoque experimental se conoce como genética inversa . Los investigadores extraen inferencias de cómo el knockdown difiere de los individuos en los que el gen de interés está operativo. Los knockdowns transitorios se utilizan a menudo en biología del desarrollo porque los oligos se pueden inyectar en cigotos unicelulares y estarán presentes en las células hijas de la célula inyectada durante el desarrollo embrionario . [3] El término knockdown genético apareció por primera vez en la literatura en 1994 [4]
La interferencia de ARN (ARNi) es un medio para silenciar genes mediante la degradación del ARNm. [5] La inhibición de genes mediante este método se logra introduciendo pequeños ARN interferentes de doble cadena (ARNip) en el citoplasma. Los ARN interferentes pequeños pueden originarse en el interior de la célula o pueden introducirse exógenamente en la célula. Una vez introducidos en la célula, los ARNip exógenos son procesados por el complejo de silenciamiento inducido por ARN ( RISC ). [6] El ARNip es complementario al ARNm objetivo que se va a silenciar, y el RISC utiliza el ARNip como plantilla para localizar el ARNm objetivo. Después de que el RISC se localiza en el ARNm objetivo, el ARN es escindido por una ribonucleasa.
La interferencia de ARN se utiliza ampliamente como técnica de laboratorio para el análisis funcional genético. [7] La interferencia de ARN en organismos como C. elegans y Drosophila melanogaster proporciona un medio rápido y económico de investigar la función genética. En la investigación de C. elegans , la disponibilidad de herramientas como la biblioteca de interferencia de ARN de Ahringer ofrece a los laboratorios una forma de probar muchos genes en una variedad de contextos experimentales. Los conocimientos obtenidos del uso experimental de la interferencia de ARN pueden ser útiles para identificar posibles objetivos terapéuticos, el desarrollo de fármacos u otras aplicaciones. [8] La interferencia de ARN es una herramienta de investigación muy útil, que permite a los investigadores realizar grandes exámenes genéticos en un esfuerzo por identificar objetivos para futuras investigaciones relacionadas con una vía, un fármaco o un fenotipo en particular. [9] [10]
Un medio diferente de silenciar el ADN exógeno que se ha descubierto en procariotas es un mecanismo que involucra loci llamados 'Repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas', o CRISPRs . [11] Los genes asociados a CRISPR (cas) codifican la maquinaria celular que corta el ADN exógeno en pequeños fragmentos y los inserta en un locus de repetición CRISPR. Cuando esta región CRISPR del ADN es expresada por la célula, los pequeños ARN producidos a partir de los insertos de ADN exógeno sirven como una secuencia de plantilla que otras proteínas Cas usan para silenciar esta misma secuencia exógena. Las transcripciones de las secuencias exógenas cortas se usan como guía para silenciar estos ADN extraños cuando están presentes en la célula. Esto sirve como una especie de inmunidad adquirida, y este proceso es como un mecanismo de interferencia de ARN procariota. Las repeticiones CRISPR se conservan en muchas especies y se ha demostrado que se pueden utilizar en células humanas, [12] bacterias, [13] C. elegans , [14] pez cebra , [15] y otros organismos para la manipulación eficaz del genoma. El uso de CRISPR como herramienta de investigación versátil se puede ilustrar [16] con muchos estudios que lo utilizan para generar organismos con alteraciones del genoma.
Otra tecnología que se hace posible gracias a la manipulación del genoma procariota es el uso de nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción ( TALEN ) para dirigirse a genes específicos. [17] Las TALEN son nucleasas que tienen dos componentes funcionales importantes: un dominio de unión al ADN y un dominio de escisión del ADN. El dominio de unión al ADN es una secuencia efectora similar a un activador de la transcripción específica de la secuencia, mientras que el dominio de escisión del ADN se origina a partir de una endonucleasa bacteriana y no es específico. Las TALEN se pueden diseñar para escindir una secuencia especificada por la secuencia de la porción efectora similar a un activador de la transcripción del constructo. Una vez diseñada, una TALEN se introduce en una célula como un plásmido o ARNm. La TALEN se expresa, se localiza en su secuencia objetivo y escinde un sitio específico. Después de la escisión de la secuencia de ADN objetivo por la TALEN, la célula utiliza la unión de extremos no homólogos como un mecanismo de reparación del ADN para corregir la escisión. El intento de la célula de reparar la secuencia escindida puede hacer que la proteína codificada deje de ser funcional, ya que este mecanismo de reparación introduce errores de inserción o eliminación en el sitio reparado.
Hasta ahora, los organismos knockdown con alteraciones permanentes en su ADN se han diseñado principalmente con fines de investigación. También conocidos simplemente como knockdowns , estos organismos se utilizan con mayor frecuencia para la genética inversa, especialmente en especies como ratones o ratas para las que las tecnologías de knockdown transitorio no se pueden aplicar fácilmente. [3] [18]
Hay varias empresas que ofrecen servicios comerciales relacionados con tratamientos de derribo genético.