Los anticuerpos policlonales (pAb) son anticuerpos secretados por diferentes linajes de células B dentro del cuerpo (mientras que los anticuerpos monoclonales provienen de un solo linaje de células). Son un conjunto de moléculas de inmunoglobulina que reaccionan contra un antígeno específico, identificando cada una un epítopo diferente .
El procedimiento general para producir anticuerpos policlonales es el siguiente:
Se inyecta un conjugado antígeno/adyuvante en un animal de elección para iniciar una respuesta inmune amplificada. Después de una serie de inyecciones durante un período de tiempo específico, se espera que el animal haya creado anticuerpos contra el conjugado. Luego se extrae sangre del animal y luego se purifica para obtener el anticuerpo de interés.
La inoculación se realiza en un mamífero adecuado , como un ratón, un conejo o una cabra. A menudo se prefieren los mamíferos más grandes ya que la cantidad de suero que se puede recolectar es mayor. Se inyecta un antígeno en el mamífero. Esto induce a los linfocitos B a producir inmunoglobulinas IgG específicas para el antígeno. Esta IgG policlonal se purifica a partir del suero del mamífero .
Por el contrario, los anticuerpos monoclonales se derivan de una única línea celular.
Existen muchas metodologías para la producción de anticuerpos policlonales en animales de laboratorio. Las pautas institucionales que rigen el uso de animales y los procedimientos relacionados con estas metodologías generalmente se orientan en torno a consideraciones humanas y conducta apropiada para el uso de adyuvantes (agentes que modifican el efecto de otros agentes pero que tienen pocos o ningún efecto directo cuando se administran por sí solos). Esto incluye selección de adyuvante, rutas y sitios de administración, volúmenes de inyección por sitio y número de sitios por animal. Las políticas institucionales generalmente incluyen volúmenes permitidos de sangre por recolección y precauciones de seguridad que incluyen sujeción adecuada y sedación o anestesia de los animales para prevenir lesiones a los animales o al personal.
El objetivo principal de la producción de anticuerpos en animales de laboratorio es obtener antisueros de alto título y alta afinidad para su uso en experimentación o pruebas de diagnóstico. Los adyuvantes se utilizan para mejorar o potenciar una respuesta inmune a los antígenos. La mayoría de los adyuvantes proporcionan un lugar de inyección, un depósito de antígeno que permite una liberación lenta del antígeno en los ganglios linfáticos de drenaje.
Muchos adyuvantes también contienen o actúan directamente como:
Estos antígenos por sí solos son generalmente inmunógenos deficientes. La mayoría de los antígenos proteicos complejos inducen múltiples clones de células B durante la respuesta inmune, por lo que la respuesta es policlonal. Las respuestas inmunes a los antígenos no proteicos generalmente son deficientes o están mejoradas por los adyuvantes y no hay memoria en el sistema.
Actualmente también se producen anticuerpos a partir del aislamiento de linfocitos B humanos para producir mezclas específicas de anticuerpos monoclonales recombinantes. La empresa biotecnológica Symphogen desarrolla este tipo de anticuerpos para aplicaciones terapéuticas. Son la primera empresa de investigación en alcanzar la fase dos de ensayos con mezclas de anticuerpos monoclonales que imitan la diversidad de los fármacos de anticuerpos policlonales. Esta producción previene la transmisión viral y priónica y este es un proceso simple.
Los animales utilizados frecuentemente para la producción de anticuerpos policlonales incluyen pollos, cabras, cobayas, hámsteres, caballos, ratones, ratas y ovejas. Sin embargo, el conejo es el animal de laboratorio más utilizado para este fin. La selección de animales debe basarse en:
Generalmente se utilizan cabras o caballos cuando se requieren grandes cantidades de antisueros. Muchos investigadores prefieren los pollos debido a su distancia filogenética de los mamíferos. Los pollos transfieren grandes cantidades de IgY (IgG) a la yema del huevo y la recolección de anticuerpos de los huevos elimina la necesidad del procedimiento de sangrado invasivo. Los huevos de una semana pueden contener 10 veces más anticuerpos que el volumen de sangre de conejo obtenido de un sangrado semanal. Sin embargo, existen algunas desventajas cuando se utilizan ciertos anticuerpos derivados de pollo en inmunoensayos. La IgY de pollo no fija el componente C1 del complemento de los mamíferos y no actúa como anticuerpo precipitante utilizando soluciones estándar.
Aunque los ratones se utilizan con mayor frecuencia para la producción de anticuerpos monoclonales, su pequeño tamaño generalmente impide su uso para cantidades suficientes de anticuerpos policlonales séricos. Sin embargo, los anticuerpos policlonales en ratones se pueden recolectar del líquido ascítico utilizando cualquiera de varias metodologías de producción de ascitis.
Cuando se utilizan conejos, se deben utilizar animales adultos jóvenes (de 2,5 a 3,0 kg o de 5,5 a 6,5 libras) para la inmunización primaria debido a la vigorosa respuesta de anticuerpos. La función inmune alcanza su punto máximo en la pubertad y las respuestas primarias a nuevos antígenos disminuyen con la edad. Generalmente se prefieren las conejas porque son más dóciles y se dice que generan una respuesta inmune más vigorosa que los machos. Se deben utilizar al menos dos animales por antígeno cuando se utilicen animales exógenos. Este principio reduce el posible fracaso total resultante de la falta de respuesta a los antígenos de animales individuales.
El tamaño, el grado de agregación y la natividad relativa de los antígenos proteicos pueden afectar dramáticamente la calidad y cantidad de anticuerpos producidos. Los polipéptidos pequeños (<10 ku ) y los antígenos no proteicos generalmente necesitan conjugarse o entrecruzarse con proteínas portadoras inmunogénicas más grandes para aumentar la inmunogenicidad y proporcionar epítopos de células T. Generalmente, cuanto mayor sea la proteína inmunogénica, mejor. Las proteínas más grandes, incluso en cantidades más pequeñas, generalmente dan como resultado una mejor participación de las células presentadoras de antígenos que procesan el antígeno para una respuesta inmune satisfactoria. La inyección de proteínas solubles no agregadas tiene una mayor probabilidad de inducir tolerancia que una respuesta de anticuerpos satisfactoria.
La hemocianina de lapa californiana (KLH) y la albúmina sérica bovina son dos proteínas portadoras ampliamente utilizadas. La poli-L-lisina también se ha utilizado con éxito como columna vertebral de péptidos. Aunque el uso de poli-L-lisina reduce o elimina la producción de anticuerpos contra proteínas extrañas, puede provocar un fallo en la producción de anticuerpos inducida por péptidos. Recientemente, los liposomas también se han utilizado con éxito para la administración de péptidos pequeños y esta técnica es una alternativa a la administración con adyuvantes de emulsión oleosa.
La selección de la cantidad de antígeno para la inmunización varía según las propiedades del antígeno y el adyuvante seleccionado. En general, se necesitan cantidades de microgramos a miligramos de proteína en el adyuvante para provocar títulos elevados de anticuerpos. La dosis de antígeno generalmente está asociada a la especie, más que al peso corporal. La llamada “ventana” de inmunogenicidad en cada especie es amplia, pero demasiado o muy poco antígeno puede inducir tolerancia, supresión o desviación inmune hacia la inmunidad celular en lugar de una respuesta humoral satisfactoria. Se han informado niveles óptimos y habituales de antígenos proteicos para inmunizar especies específicas en los siguientes rangos:
Se informa que las dosis óptimas de "cebado" se encuentran en el extremo inferior de cada rango.
La afinidad de los anticuerpos séricos aumenta con el tiempo (meses) después de la inyección de mezclas de antígeno y adyuvante y a medida que disminuye el antígeno en el sistema. Las dosis de antígenos ampliamente utilizadas para las inmunizaciones secundarias o de “refuerzo” suelen ser la mitad para igualar las dosis iniciales. Los antígenos deben estar libres de subproductos preparativos y productos químicos como gel de poliacrilamida, SDS, urea, endotoxinas, partículas y pH extremos.
Cuando se utiliza un péptido para generar el anticuerpo, es extremadamente importante diseñar los antígenos correctamente. Existen varios recursos que pueden ayudar en el diseño, así como empresas que ofrecen este servicio. Expasy ha agregado un conjunto de herramientas públicas en su página ProtScale que requieren cierto grado de conocimiento del usuario para navegar. Para obtener una herramienta de puntuación de péptidos más sencilla, hay disponible una herramienta Antigen Profiler que le permitirá puntuar secuencias de péptidos individuales basándose en una base de datos de mapeo de epítopos de relación de inmunógenos anteriores utilizados para generar anticuerpos. Finalmente, como regla general los péptidos deben seguir algunos criterios básicos.
Al examinar péptidos para síntesis e inmunización, se recomienda evitar ciertos residuos y secuencias debido a posibles problemas de síntesis. Esto incluye algunas de las características más comunes:
Los investigadores también deben considerar el estado de nacimiento de los antígenos proteicos cuando se utilizan como inmunógenos y la reacción con los anticuerpos producidos. Los anticuerpos contra proteínas nativas reaccionan mejor con proteínas nativas y los anticuerpos contra proteínas desnaturalizadas reaccionan mejor con proteínas desnaturalizadas. Si los anticuerpos provocados se van a utilizar en transferencias de membrana (proteínas sometidas a condiciones desnaturalizantes), entonces se deben producir anticuerpos contra proteínas desnaturalizadas. Por otro lado, si se van a utilizar anticuerpos para reaccionar con una proteína nativa o bloquear un sitio activo de una proteína, entonces se deben producir anticuerpos contra la proteína nativa. Los adyuvantes a menudo pueden alterar la naturaleza de la proteína. Generalmente, los antígenos proteicos absorbidos en un adyuvante de emulsión de aceite en agua preformado retienen una mayor estructura proteica nativa que aquellos en emulsiones de agua en aceite.
Los antígenos siempre deben prepararse utilizando técnicas que garanticen que estén libres de contaminación microbiana. La mayoría de las preparaciones de antígenos proteicos pueden esterilizarse pasándolas a través de un filtro de 0,22 µm. Los abscesos sépticos suelen aparecer en los lugares de inoculación de los animales cuando se utilizan preparados contaminados. Esto puede provocar un fracaso de la inmunización contra el antígeno objetivo.
Hay muchos adyuvantes inmunológicos disponibles comercialmente . La selección de adyuvantes o tipos específicos varía dependiendo de si se utilizarán para la investigación y la producción de anticuerpos o en el desarrollo de vacunas. Los adyuvantes para uso en vacunas sólo necesitan producir anticuerpos protectores y una buena memoria sistémica, mientras que los destinados a la producción de antisueros necesitan inducir rápidamente anticuerpos con títulos elevados y gran avidez. Ningún adyuvante es ideal para todos los propósitos y todos tienen ventajas y desventajas. El uso de adyuvantes generalmente va acompañado de efectos secundarios indeseables de diversa gravedad y duración. La investigación sobre nuevos adyuvantes se centra en sustancias que tienen una toxicidad mínima y al mismo tiempo conservan la máxima inmunoestimulación. Los investigadores siempre deben ser conscientes del dolor y la angustia potenciales asociados con el uso de adyuvantes en animales de laboratorio.
Los adyuvantes más utilizados para la producción de anticuerpos son Freund's, Alum, Ribi Adjuvant System y Titermax.
Digoxina Immune Fab es el fragmento de unión a antígeno de anticuerpos policlonales generados contra el derivado de Digitalis como un hapteno unido a una proteína y se utiliza para revertir la toxicidad de digoxina o digitoxina potencialmente mortal . [1] [2] [3]
La inmunoglobulina Rho(D) se elabora a partir de una mezcla de plasma humano proporcionado por donantes Rh negativos con anticuerpos contra el antígeno D. Se utiliza para proporcionar una unión inmunitaria pasiva del antígeno, previniendo una respuesta inmunitaria activa materna que podría provocar una enfermedad hemolítica del recién nacido . [4] [5]
Rozrolimupab es el anticuerpo policlonal humano recombinante anti- RhD compuesto por 25 anticuerpos IgG1 únicos y se utiliza para el tratamiento de la púrpura trombocitopénica inmunitaria y la prevención de la isoinmunización en mujeres embarazadas Rh negativas .
REGN-COV2 ( Regeneron Pharmaceuticals ): tratamiento potencial para personas con COVID-19 y para prevenir la infección por coronavirus SARS-CoV-2 .
El uso de anticuerpos policlonales (PAbs) sobre los anticuerpos monoclonales tiene sus ventajas. Las habilidades técnicas necesarias para producir anticuerpos policlonales no son tan exigentes. Son económicos de fabricar y se pueden generar con bastante rapidez, y su producción demora varios meses. Los PAbs son heterogéneos, lo que les permite unirse a una amplia gama de epítopos de antígenos. Debido a que los PAb se producen a partir de una gran cantidad de clones de células B, es más probable que se unan con éxito a un antígeno específico. Los PAbs permanecen estables en diferentes ambientes, como un cambio en el pH o la concentración de sal, lo que les permite ser más aplicables en ciertos procedimientos. Además, dependiendo de la cantidad necesaria, los PAbs se pueden producir en grandes cantidades en relación con el tamaño del animal utilizado. [6] [7] [8]