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Amplificación isotérmica mediada por bucle

Proceso de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) [1]

La amplificación isotérmica mediada por bucle ( LAMP ) es una técnica de un solo tubo para la amplificación de ADN [2] con fines diagnósticos y una alternativa de bajo coste para detectar ciertas enfermedades. [3] LAMP es una técnica de amplificación isotérmica de ácidos nucleicos . A diferencia de la tecnología de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), en la que la reacción se lleva a cabo con una serie de pasos o ciclos de temperatura alterna, la amplificación isotérmica se lleva a cabo a una temperatura constante y no requiere un termociclador . LAMP fue inventada en 1998 por Eiken Chemical Company en Tokio. [1] La amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP) combina LAMP con un paso de transcripción inversa para permitir la detección de ARN.

Amplificación

Cebadores de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) [1]
Producto de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) [1]

En LAMP, la secuencia diana se amplifica a una temperatura constante de 60–65 °C (140–149 °F) utilizando dos o tres conjuntos de cebadores y un fragmento de Klenow Bst similar a la polimerasa con alta actividad de desplazamiento de cadena además de una actividad de replicación. Normalmente, se utilizan 4 cebadores diferentes para amplificar 6 regiones distintas en el gen diana, lo que aumenta la especificidad. Un par adicional de "cebadores de bucle" puede acelerar aún más la reacción. [4] La cantidad de ADN producida en LAMP es considerablemente mayor que la amplificación basada en PCR . [1] El diseño de cebadores se puede realizar utilizando varios programas, como PrimerExplorer, MorphoCatcher, [5] y NEB LAMP Primer Design Tool. Para la detección de polimorfismos de nucleótidos conservadores y específicos de la especie, en la mayoría de las aplicaciones de diagnóstico una combinación de PrimerExplorer y MorphoCatcher es muy útil, porque permite la localización de nucleótidos específicos de la especie en los extremos 3' de los cebadores para mejorar la especificidad de las reacciones.

Esquema de un LAMP de biomarcadores de ácidos nucleicos a partir de muestras de aguas residuales sin tratar, para cuantificar rápidamente el ADN mitocondrial (ADNmt) específico de humanos. [6]

Detección

El producto de amplificación se puede detectar mediante fotometría , midiendo la turbidez causada por el precipitado de pirofosfato de magnesio en solución como subproducto de la amplificación. [7] Esto permite una fácil visualización a simple vista o mediante enfoques de detección fotométrica simples para volúmenes pequeños. La reacción se puede seguir en tiempo real ya sea midiendo la turbidez [8] o mediante fluorescencia utilizando colorantes intercalantes como SYTO 9. [9]

Los colorantes, como el verde SYBR , se pueden utilizar para crear un cambio de color visible que se puede ver a simple vista sin la necesidad de un equipo costoso, o para una respuesta que se puede medir con mayor precisión mediante instrumentación. Las moléculas de colorante se intercalan o etiquetan directamente el ADN y, a su vez, se pueden correlacionar con el número de copias presentes inicialmente. Por lo tanto, LAMP también puede ser cuantitativo. La detección en tubo de la amplificación de ADN LAMP es posible utilizando calceína cargada con manganeso que comienza a fluorescer tras la complejación del manganeso con pirofosfato durante la síntesis de ADN in vitro. [10] Otro método para la detección visual de los amplicones LAMP a simple vista se basó en su capacidad para hibridar con ADN monocatenario (ssDNA) unido a nanopartículas de oro (AuNP) complementarias y así evitar el cambio de color normal de rojo a azul púrpura que de otro modo ocurriría durante la agregación inducida por sal de las partículas de oro. Por lo tanto, un método LAMP combinado con detección de amplicones por AuNP puede tener ventajas sobre otros métodos en términos de tiempo de ensayo reducido, confirmación de amplicones por hibridación y uso de equipos más simples (es decir, no se necesita un termociclador, un equipo de electroforesis o un transiluminador UV). [11] [12]

Detecciones colorimétricas [13]

Los indicadores de colorante dependientes del pH, como el rojo fenol, inducen un cambio de color de rosa a amarillo cuando el valor de pH de la reacción disminuye tras la amplificación del ADN. [13] Debido a su pronunciado cambio de color, esta es la lectura más comúnmente utilizada para los ensayos RT-LAMP. [13] Sin embargo, la lectura dependiente del cambio de pH requiere una solución de reacción débilmente amortiguada, lo que plantea un gran desafío cuando se utilizan entradas de muestra crudas con pH variable. [13] Un segundo ensayo colorimétrico utiliza indicadores de iones metálicos como el azul de hidroxinaftol (HNB), que cambia de color de púrpura a azul tras una caída de iones Mg 2+ libres, que forman un precipitado de pirofosfato de Mg- tras la amplificación del ADN. [13]

Usos y beneficios

LAMP es una técnica de amplificación de ADN relativamente nueva, que debido a su simplicidad, robustez y bajo costo podría proporcionar importantes ventajas. LAMP tiene el potencial de ser utilizada como un ensayo de detección simple en el campo o en el punto de atención por parte de los médicos. [14] Debido a que LAMP es isotérmica, lo que erradica la necesidad de termocicladores costosos utilizados en PCR convencional, puede ser un método particularmente útil para el diagnóstico de enfermedades infecciosas en países de ingresos bajos y medios. [15] LAMP se está estudiando ampliamente para detectar enfermedades infecciosas como la filariasis, [16] el virus Zika, [17] la tuberculosis, [18] la malaria, [19] [20] [21] la enfermedad del sueño, [22] y el SARS-CoV-2 . [23] [24] En las regiones en desarrollo, aún debe validarse ampliamente para otros patógenos comunes. [14]

Se ha observado que la LAMP es menos sensible (más resistente) que la PCR a los inhibidores en muestras complejas como la sangre, probablemente debido al uso de una ADN polimerasa diferente (normalmente la ADN polimerasa Bst – Bacillus stearothermophilus – en lugar de la Taq polimerasa como en la PCR). Varios informes describen la detección exitosa de patógenos a partir de muestras mínimamente procesadas, como sangre tratada térmicamente, [25] [26] o en presencia de matrices de muestras clínicas. [27] Esta característica de la LAMP puede ser útil en entornos de bajos recursos o de campo donde una extracción convencional de ADN o ARN antes de las pruebas de diagnóstico puede ser poco práctica.

El LAMP también se ha utilizado para ayudar a identificar fluidos corporales. Gracias a su simplicidad, los investigadores pueden analizar una o más muestras con poco tiempo de intervención, lo que ayuda a reducir el tiempo necesario para obtener los resultados. Los investigadores también han podido añadir factores para que la identificación sea aún más sencilla, como el tinte indicador de metal y el rojo fenol, para poder utilizar un teléfono inteligente y el ojo desnudo, respectivamente, para analizar los resultados. [28] [29] [30]

Limitaciones

La LAMP es menos versátil que la PCR, la técnica de amplificación de ácidos nucleicos más consolidada. La LAMP es útil principalmente como técnica de diagnóstico o detección, pero no es útil para la clonación o muchas otras aplicaciones de biología molecular que se pueden hacer con la PCR. Debido a que la LAMP utiliza 4 (o 6) cebadores que se dirigen a 6 (u 8) regiones dentro de un segmento bastante pequeño del genoma, y ​​debido a que el diseño de cebadores está sujeto a numerosas limitaciones, es difícil diseñar conjuntos de cebadores para LAMP "a ojo". Generalmente se utilizan paquetes de software gratuitos, de código abierto [31] o comerciales para ayudar con el diseño de cebadores para LAMP, aunque las limitaciones del diseño de cebadores significan que hay menos libertad para elegir el sitio de destino que con la PCR.

En una aplicación diagnóstica, esto debe equilibrarse con la necesidad de elegir un objetivo apropiado (por ejemplo, un sitio conservado en un genoma viral altamente variable, o un objetivo que sea específico para una cepa particular de patógeno). Es posible que se requieran múltiples secuencias degeneradas para cubrir las diferentes cepas variantes de la misma especie. Una consecuencia de tener un cóctel de iniciadores de este tipo puede ser una amplificación no específica en la amplificación tardía. [ cita requerida ]

Los métodos de multiplexación para LAMP están menos desarrollados que para PCR. El mayor número de cebadores por diana en LAMP aumenta la probabilidad de interacciones cebador-cebador para conjuntos de dianas multiplexadas. El producto de LAMP es una serie de concatémeros de la región diana, lo que da lugar a un patrón de "escalera" o banda característico en un gel, en lugar de una única banda como con PCR. Aunque esto no es un problema cuando se detectan dianas individuales con LAMP, las aplicaciones de PCR multiplex "tradicionales" (de punto final) en las que la identidad de una diana se confirma por el tamaño de una banda en un gel no son factibles con LAMP. La multiplexación en LAMP se ha logrado eligiendo una región diana con un sitio de restricción y digiriendo antes de ejecutarla en un gel, de modo que cada producto da lugar a un tamaño distinto de fragmento, [32] aunque este enfoque agrega complejidad al diseño y protocolo experimental.

El uso de una ADN polimerasa que desplaza cadenas en LAMP también excluye el uso de sondas de hidrólisis, por ejemplo, las sondas TaqMan , que dependen de la actividad exonucleasa 5'-3' de la Taq polimerasa. Se ha informado de un enfoque alternativo de multiplexación en tiempo real basado en supresores de fluorescencia. [33]

Se puede añadir el colorante verde SYBR para ver LAMP en tiempo real. Sin embargo, en la fase tardía de amplificación, la amplificación del dímero del cebador puede contribuir a una señal de falso positivo. El uso de pirofosfatasa inorgánica en una mezcla de reacción SYBR permite el uso del análisis de fusión para distinguir la amplificación correcta [34]

Aunque se han propuesto diferentes estrategias de mitigación para los resultados falsos positivos en ensayos basados ​​en este método, la amplificación no específica debido a varios factores, incluida la ausencia de mecanismos de regulación de la temperatura, es una de las principales limitaciones de la amplificación isotérmica mediada por bucle. [35] [36]

Por último, debido a que LAMP requiere temperaturas de incubación elevadas y mantenidas (60–65 °C), se requiere algún tipo de mecanismo de calentamiento, termostato y/o aislante (aunque no necesariamente un termociclador). Este requisito hace que LAMP sea menos adecuada para diagnósticos en el punto de atención en el campo, que idealmente funcionarían a temperatura ambiente. [ cita requerida ]

Investigación

La amplificación asistida por hibridación de ARNasa (RHAM) integra LAMP con la notificación fluorescente mediada por ARNasa HII . Este método emplea un conjunto de cebadores LAMP convencionales para amplificar exponencialmente la secuencia objetivo, seguido de la hibridación de una sonda fluorescente que contiene ribonucleótidos con el producto de amplificación. Luego, la ARNasa HII escinde la sonda, lo que libera una señal fluorescente que puede detectarse. [37] [38]

Referencias

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