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Código genético ampliado

No debe haber comunicación cruzada entre el nuevo par ARNt/sintasa y las moléculas ARNt/sintasa existentes, solo con los ribosomas.

Un código genético expandido es un código genético modificado artificialmente en el que uno o más codones específicos han sido reasignados para codificar un aminoácido que no se encuentra entre los 22 aminoácidos proteinogénicos codificados naturalmente comunes . [1]

Los requisitos clave para ampliar el código genético son:

La expansión del código genético es un área de investigación de la biología sintética , una disciplina biológica aplicada cuyo objetivo es diseñar sistemas vivos para fines útiles. La expansión del código genético enriquece el repertorio de herramientas útiles disponibles para la ciencia.

En mayo de 2019, los investigadores, en un esfuerzo histórico, informaron sobre la creación de una nueva forma sintética (posiblemente artificial ) de vida viable , una variante de la bacteria Escherichia coli , al reducir el número natural de 64 codones en el genoma bacteriano a 61 codones (eliminando dos de los seis codones que codifican serina y uno de los tres codones de terminación ), de los cuales 59 se utilizan para codificar 20 aminoácidos . [2] [3]

Introducción

Cabe destacar que el código genético de todos los organismos es básicamente el mismo, de modo que todos los seres vivos utilizan el mismo "lenguaje genético". [4] En general, la introducción de nuevos aminoácidos no naturales funcionales en las proteínas de las células vivas rompe la universalidad del lenguaje genético, lo que idealmente conduce a formas de vida alternativas. [5] Las proteínas se producen gracias a las moléculas del sistema de traducción, que decodifican los mensajes del ARN en una cadena de aminoácidos. La traducción de la información genética contenida en el ARN mensajero (ARNm) en una proteína es catalizada por los ribosomas . Los ARN de transferencia (ARNt) se utilizan como claves para decodificar el ARNm en su polipéptido codificado . El ARNt reconoce un codón específico de tres nucleótidos en el ARNm con una secuencia complementaria llamada anticodón en uno de sus bucles. Cada codón de tres nucleótidos se traduce en uno de los veinte aminoácidos naturales. [6] Hay al menos un ARNt para cualquier codón, y a veces varios codones codifican para el mismo aminoácido. Muchos ARNt son compatibles con varios codones. Una enzima llamada aminoacil ARNt sintetasa une covalentemente el aminoácido al ARNt apropiado. [7] La ​​mayoría de las células tienen una sintetasa diferente para cada aminoácido (20 o más sintetasas). Por otro lado, algunas bacterias tienen menos de 20 aminoacil ARNt sintetasas e introducen el o los aminoácidos "faltantes" mediante la modificación de un aminoácido estructuralmente relacionado por una enzima aminotransferasa . [8] Una característica explotada en la expansión del código genético es el hecho de que la aminoacil ARNt sintetasa a menudo no reconoce el anticodón, sino otra parte del ARNt, lo que significa que si el anticodón fuera mutado, la codificación de ese aminoácido cambiaría a un nuevo codón. En el ribosoma, la información del ARNm se traduce en un aminoácido específico cuando el codón del ARNm coincide con el anticodón complementario de un ARNt, y el aminoácido unido se añade a una cadena polipeptídica en crecimiento. Cuando se libera del ribosoma, la cadena polipeptídica se pliega y forma una proteína funcional. [7]

Para incorporar un nuevo aminoácido al código genético se requieren varios cambios. En primer lugar, para una traducción exitosa de un nuevo aminoácido, el codón al que se asigna el nuevo aminoácido no puede codificar ya uno de los 20 aminoácidos naturales. Por lo general, se utiliza un codón sin sentido ( codón de terminación ) o un codón de cuatro bases. [6] En segundo lugar, se requiere un nuevo par de ARNt y aminoacil ARNt sintetasa, estos se denominan conjunto ortogonal. El conjunto ortogonal no debe interactuar con los conjuntos de ARNt y sintetasa endógenos, al mismo tiempo que sigue siendo funcionalmente compatible con el ribosoma y otros componentes del aparato de traducción. El sitio activo de la sintetasa se modifica para aceptar solo el nuevo aminoácido. Lo más frecuente es que se examine una biblioteca de sintetasas mutantes para encontrar una que cargue el ARNt con el aminoácido deseado. La sintetasa también se modifica para reconocer solo el ARNt ortogonal. [6] El par ARNt sintetasa a menudo se diseña en otras bacterias o células eucariotas. [9]

En esta área de investigación, los 20 aminoácidos proteinogénicos codificados se denominan aminoácidos estándar o, alternativamente, aminoácidos naturales o canónicos, mientras que los aminoácidos agregados se denominan aminoácidos no estándar (NSAA), o aminoácidos no naturales (uAA; término que no se utiliza en artículos que tratan de aminoácidos naturales no proteinogénicos, como la fosfoserina ), o aminoácidos no canónicos.

Aminoácidos no estándar

Tirosina y algunas variantes sintéticas de tirosina utilizadas para el marcaje de proteínas. Se han sintetizado diferentes variantes de tirosina que pueden incorporarse a las proteínas utilizando un código genético expandido. Las variantes que se muestran aquí se utilizan para la unión química o fotoquímica. Esto significa que el AA incorporado reacciona específicamente con un grupo químico particular (como hidrazidas, aminas, azidas o tioles) o puede activarse con rayos UV para reticularse con otros AA.

El primer elemento del sistema es el aminoácido que se añade al código genético de una determinada cepa de organismo.

Se han añadido más de 71 NSAA diferentes a diferentes cepas de E. coli , levaduras o células de mamíferos. [10] Debido a detalles técnicos (síntesis química más sencilla de NSAA, menor diafonía y evolución más sencilla de la aminoacil-ARNt sintasa), los NSAA son generalmente más grandes que los aminoácidos estándar y con mayor frecuencia tienen un núcleo de fenilalanina pero con una gran variedad de sustituyentes diferentes. Estos permiten un gran repertorio de nuevas funciones, como el etiquetado (ver figura), como reportero fluorescente ( p. ej., dansilalanina) [11] o para producir proteínas traduccionales en E. coli con modificaciones postraduccionales eucariotas ( p. ej. , fosfoserina, fosfotreonina y fosfotirosina). [10] [12]

El trabajo fundacional fue informado por Rolf Furter, quien utilizó por sí solo el par de ARNt Phe /PheRS de levadura para incorporar p-yodofenilalanina en E. coli . [13]

Los aminoácidos no naturales incorporados en las proteínas incluyen aminoácidos que contienen átomos pesados ​​para facilitar ciertos estudios cristalográficos de rayos X; aminoácidos con nuevas propiedades estéricas/de empaquetamiento y electrónicas; aminoácidos fotorreticulados que se pueden utilizar para investigar interacciones proteína-proteína in vitro o in vivo; aminoácidos que contienen ceto, acetileno, azida y boronato que se pueden utilizar para introducir selectivamente una gran cantidad de sondas biofísicas, etiquetas y nuevos grupos funcionales químicos en proteínas in vitro o in vivo ; aminoácidos activos redox para investigar y modular la transferencia de electrones; aminoácidos fotoisomerizables y fotoenjaulados para fotorregular procesos biológicos; aminoácidos de unión a metales para catálisis y detección de iones metálicos; aminoácidos que contienen cadenas laterales activas fluorescentes o infrarrojas para investigar la estructura y dinámica de las proteínas; α-hidroxiácidos y D -aminoácidos como sondas de conformación de la cadena principal e interacciones de enlaces de hidrógeno; y aminoácidos sulfatados y miméticos de aminoácidos fosforilados como sondas de modificaciones postraduccionales. [14] [15] [16]

La disponibilidad del aminoácido no estándar requiere que el organismo lo importe del medio o lo biosintetice. En el primer caso, el aminoácido no natural se sintetiza primero químicamente en su forma L ópticamente pura . [17] Luego se agrega al medio de crecimiento de la célula. [10] Por lo general, se prueba una biblioteca de compuestos para su uso en la incorporación del nuevo aminoácido, pero esto no siempre es necesario, por ejemplo, varios sistemas de transporte pueden manejar aminoácidos no naturales con cadenas laterales apolares. En el segundo caso, se necesita diseñar una ruta biosintética, por ejemplo, una cepa de E. coli que biosintetice un aminoácido nuevo (p-aminofenilalanina) a partir de fuentes de carbono básico y lo incluya en su código genético. [16] [18] [19] Otro ejemplo: la producción de fosfoserina, un metabolito natural, y en consecuencia se requiere la alteración del flujo de su ruta para aumentar su producción. [12]

Asignación de codones

Otro elemento del sistema es un codón para asignar el nuevo aminoácido. [ cita requerida ]

Un problema importante para la expansión del código genético es que no hay codones libres. El código genético tiene una disposición no aleatoria que muestra signos reveladores de varias fases de la evolución primordial, sin embargo, desde entonces se ha congelado en su lugar y se conserva casi universalmente. [20] Sin embargo, algunos codones son más raros que otros. De hecho, en E. coli (y en todos los organismos) el uso de codones no es igual, sino que presenta varios codones raros (ver tabla), siendo el más raro el codón de terminación ámbar (UAG).

Supresión del codón ámbar

La posibilidad de reasignar codones fue comprendida por Normanly et al. en 1990, cuando una cepa mutante viable de E. coli leyó a través del codón de terminación UAG ("ámbar") . [22] Esto fue posible gracias a la rareza de este codón y al hecho de que el factor de liberación 1 por sí solo hace que el codón ámbar termine la traducción. Más tarde, en el laboratorio de Schultz , se utilizó la tRNATyr/tirosil-tRNA sintetasa (TyrRS) de Methanococcus jannaschii , una arqueobacteria, [6] para introducir una tirosina en lugar de STOP, el valor predeterminado del codón ámbar. [23] Esto fue posible debido a las diferencias entre las síntesis bacterianas endógenas y la sintasa arqueal ortóloga, que no se reconocen entre sí. Posteriormente, el grupo desarrolló el par tRNA/sintasa ortólogo para utilizar el aminoácido no estándar O -metiltirosina. [6] A esta le siguieron la naftilalanina de mayor tamaño [24] y la benzoilfenilalanina fotorreticulada [25] , lo que demostró la utilidad potencial del sistema.

El codón ámbar es el codón menos utilizado en Escherichia coli , pero su secuestro da como resultado una pérdida sustancial de aptitud. De hecho, un estudio encontró que había al menos 83 péptidos afectados principalmente por la lectura continua [26] . Además, el etiquetado estaba incompleto. Como consecuencia, se han creado varias cepas para reducir el costo de aptitud, incluida la eliminación de todos los codones ámbar del genoma. En la mayoría de las cepas de E. coli K-12 (a saber, Escherichia coli (biología molecular) para los pedigríes de cepas) hay 314 codones de terminación UAG. En consecuencia, se ha invertido una cantidad gigantesca de trabajo en el reemplazo de estos. Un enfoque iniciado por el grupo del profesor George Church de Harvard se denominó MAGE en CAGE: se basó en una transformación multiplex y una posterior recombinación de cepas para eliminar todos los codones UAG; la última parte presentó un punto de detención en un primer artículo, [27] pero se superó. Esto dio como resultado la cepa de E. coli C321.ΔA, que carece de todos los codones UAG y RF1. [28] Esto permitió realizar un experimento con esta cepa para hacerla "adicta" al aminoácido bifenilalanina mediante la evolución de varias enzimas clave para requerirlo estructuralmente, poniendo así su código genético expandido bajo selección positiva. [29]

Reasignación de codones de sentido raro

Además del codón ámbar, también se han considerado codones de sentido raros para su uso. El codón AGG codifica arginina, pero una cepa se ha modificado con éxito para que codifique 6- N -aliloxicarbonil-lisina. [30] Otro candidato es el codón AUA, que es inusual en el sentido de que su ARNt respectivo tiene que diferenciarse de AUG que codifica metionina (primordialmente, isoleucina, de ahí su ubicación). Para hacer esto, el ARNt AUA tiene una base especial, lisidina. La eliminación de la sintasa ( tilS ) fue posible gracias a la sustitución del ARNt nativo por el de Mycoplasma mobile (sin lisidina). La aptitud reducida es un primer paso para presionar a la cepa para que pierda todas las instancias de AUA, lo que le permite ser utilizada para la expansión del código genético. [31]

La cepa Syn61 de E. coli es una variante en la que se eliminan todos los usos de los codones TCG (Ser), TCA (Ser) y TAG (STOP) mediante un genoma sintético (véase § Genoma sintético recodificado a continuación). Al eliminar los genes de ARNt innecesarios y RF1, se produjo la cepa Syn61Δ3. Los tres codones liberados quedan entonces disponibles para añadir tres residuos especiales, como se demuestra en la cepa "Syn61Δ3(ev4)". [32]

Codones de cuatro bases (cuatrillizos)

Si bien los codones tripletes son la base del código genético en la naturaleza, el cambio de marco programado +1 es un proceso natural que permite el uso de una secuencia de cuatro nucleótidos (codón cuaternario) para codificar un aminoácido. [33] Los desarrollos recientes en la ingeniería del código genético también mostraron que el codón cuaternario podría usarse para codificar aminoácidos no estándar en condiciones experimentales. [34] [35] [36] Esto permitió el uso simultáneo de dos aminoácidos no naturales, p -azidofenilalanina (pAzF) y N6-[(2-propiniloxi)carbonil]lisina (CAK), que se reticulan entre sí por cicloadición de Huisgen . [37] La ​​decodificación cuadruplicada en cepas de tipo salvaje, no recodificadas, es muy ineficiente. [37] Esto se debe al hecho de que la interacción entre los ARNt diseñados con complejos ternarios u otros componentes de traducción no es tan favorable y fuerte como con los elementos de traducción endógenos de la célula. [38] Este problema se puede superar mediante la ingeniería y evolución específicas de ARNt que puedan decodificar codones cuádruples en cepas no recodificadas. [39] De esta manera se pueden generar hasta 4 pares de ARNt/ARNt sintetasa ortogonales cuádruples diferentes. [40] El enfoque de decodificación de codones cuádruples también se ha aplicado a la construcción de una vacuna contra el VIH-1. [41]

Par ARNt/sintetasa

Otro elemento clave es el par ARNt/sintetasa.

El conjunto ortólogo de sintetasa y ARNt se puede mutar y examinar mediante evolución dirigida para cargar el ARNt con un aminoácido diferente, incluso nuevo. Las mutaciones en el plásmido que contiene el par se pueden introducir mediante PCR propensa a errores o mediante cebadores degenerados para el sitio activo de la sintetasa. La selección implica múltiples rondas de un proceso de dos pasos, donde el plásmido se transfiere a células que expresan cloranfenicol acetil transferasa con un codón ámbar prematuro. En presencia de cloranfenicol tóxico y el aminoácido no natural, las células supervivientes habrán anulado el codón ámbar utilizando el ARNt ortogonal aminoacilado con los aminoácidos estándar o con el no natural. Para eliminar el primero, el plásmido se inserta en células con un gen barnasa (tóxico) con un codón ámbar prematuro pero sin el aminoácido no natural, eliminando todas las síntesis ortogonales que no reconocen específicamente el aminoácido no natural. [6] Además de la recodificación del ARNt a un codón diferente, se pueden mutar para reconocer un codón de cuatro bases, lo que permite opciones de codificación libre adicionales. [42] Como resultado, el aminoácido no natural introduce diversas propiedades fisicoquímicas y biológicas para ser utilizado como una herramienta para explorar la estructura y función de las proteínas o para crear proteínas nuevas o mejoradas para fines prácticos.

Se han desarrollado varios métodos para seleccionar la sintetasa que acepta únicamente el aminoácido no natural. Uno de ellos es mediante una combinación de selección positiva y negativa.

Conjuntos ortogonales en organismos modelo

Los pares ortogonales de sintetasa y ARNt que funcionan para un organismo pueden no funcionar para otro, ya que la sintetasa puede aminoacilar incorrectamente los ARNt endógenos o el ARNt puede ser aminoacilado incorrectamente por una sintetasa endógena. Como resultado, los conjuntos creados hasta la fecha difieren entre organismos.

En 2017, se informó sobre un ratón diseñado con un código genético extendido que puede producir proteínas con aminoácidos no naturales. [56]

Ribosomas ortogonales

De manera similar a los ARNt ortogonales y las aminoacil ARNt sintetasas (aaRS), los ribosomas ortogonales han sido diseñados para trabajar en paralelo a los ribosomas naturales. Lo ideal es que los ribosomas ortogonales utilicen diferentes transcripciones de ARNm que sus contrapartes naturales y, en última instancia, también deberían recurrir a un grupo separado de ARNt. Esto debería aliviar parte de la pérdida de aptitud que todavía surge actualmente de técnicas como la supresión del codón Amber. Además, los ribosomas ortogonales pueden mutarse y optimizarse para tareas específicas, como el reconocimiento de codones cuádruples. Tal optimización no es posible o es altamente desventajosa para los ribosomas naturales.

o-ribosoma

En 2005, se publicaron tres conjuntos de ribosomas que no reconocían el ARNm natural, sino que traducían un conjunto separado de ARNm ortogonal (o-ARNm). [57] Esto se logró cambiando la secuencia de reconocimiento del ARNm, la secuencia Shine-Dalgarno , y la secuencia de reconocimiento correspondiente en el ARNr 16S de los ribosomas, la llamada secuencia anti-Shine-Dalgarno. De esta manera, el apareamiento de bases, que generalmente se pierde si se muta cualquiera de las secuencias, permanece disponible. Sin embargo, las mutaciones en el ARNr 16S no se limitaron a los nucleótidos de apareamiento de bases obvio de la secuencia anti-Shine-Dalgarno clásica.

Ribo-X

En 2007, el grupo de Jason W. Chin presentó un ribosoma ortogonal, que fue optimizado para la supresión del codón Amber. [58] El ARNr 16S fue mutado de tal manera que se unió al factor de liberación RF1 con menos fuerza que el ribosoma natural. Este ribosoma no eliminó el problema de la menor aptitud celular causada por los codones de terminación suprimidos en las proteínas naturales. Sin embargo, a través de la especificidad mejorada, aumentó significativamente los rendimientos de la proteína diana sintetizada correctamente (de ~20% a >60% por ciento para un codón Amber a suprimir y de <1% a >20% para dos codones Amber).

Ribo-Q

En 2010, el grupo de Jason W. Chin presentó una versión optimizada del ribosoma ortogonal. El Ribo-Q es un ARNr 16S optimizado para reconocer ARNts, que tienen anticodones cuádruples para reconocer codones cuádruples, en lugar de los codones tripletes naturales. [37] Con este enfoque, el número de codones posibles aumenta de 64 a 256. Incluso teniendo en cuenta una variedad de codones de terminación, potencialmente podrían codificarse más de 200 aminoácidos diferentes de esta manera.

Grapado de ribosomas

Los ribosomas ortogonales descritos anteriormente se centran en la optimización del ARNr 16S. Hasta ahora, este ARNr 16S optimizado se combinó con subunidades grandes naturales para formar ribosomas ortogonales. Si el ARNr 23S, el componente principal de ARN de la subunidad ribosómica grande, también se va a optimizar, se tuvo que asegurar que no hubiera diafonía en el ensamblaje de los ribosomas ortogonales y naturales (véase la figura X B). Para garantizar que el ARNr 23S optimizado solo formara ribosomas con el ARNr 16S optimizado, los dos ARNr se combinaron en una transcripción. [59] Al insertar la secuencia del ARNr 23S en una región de bucle de la secuencia del ARNr 16S, ambas subunidades aún adoptan pliegues funcionales. Dado que los dos ARNr están vinculados y, por lo tanto, en proximidad constante, se unen preferiblemente entre sí, no a otras subunidades ribosómicas que flotan libremente. [ cita requerida ]

Centro de peptidil transferasa diseñado

En 2014, se demostró que al alterar el centro de la peptidil transferasa del ARNr 23S, se podían crear ribosomas que se nutren de grupos ortogonales de ARNt. [60] El extremo 3' de los ARNt se conserva universalmente como CCA. Las dos citidinas se aparean con dos guaninas del ARNr 23S para unir el ARNt al ribosoma. Esta interacción es necesaria para la fidelidad de la traducción. Sin embargo, al co-mutar los nucleótidos de unión de tal manera que aún puedan aparearse, se puede conservar la fidelidad de la traducción. El extremo 3' del ARNt se muta de CCA a CGA, mientras que dos nucleótidos de citidina en los sitios A y P de los ribosomas se mutan a guanidina. Esto da lugar a ribosomas que no aceptan ARNt naturales como sustratos y a ARNt que no pueden ser utilizados como sustrato por los ribosomas naturales.
Para utilizar dichos ARNt de forma eficaz, tendrían que ser aminoacilados por aaRS ortogonales específicos. La mayoría de los aaRS naturales reconocen el extremo 3' de su ARNt correspondiente. [61] [62] Todavía no se dispone de aaRS para estos ARNt mutados en 3'. Hasta ahora, solo se ha demostrado que este sistema funciona en un entorno de traducción in vitro donde la aminoacilación del ARNt ortogonal se logró utilizando las llamadas "flexizimas".Las flexizimas son ribozimas con actividad de aminoacilación del ARNt. [63]

Aplicaciones

Con un código genético expandido, el aminoácido no natural puede ser dirigido genéticamente a cualquier sitio elegido en la proteína de interés. La alta eficiencia y fidelidad de este proceso permite un mejor control de la colocación de la modificación en comparación con la modificación de la proteína postraduccionalmente, que, en general, se dirigirá a todos los aminoácidos del mismo tipo, como el grupo tiol de la cisteína y el grupo amino de la lisina. [64] Además, un código genético expandido permite que las modificaciones se realicen in vivo . La capacidad de dirigir de manera específica al sitio fracciones químicas sintetizadas en laboratorio hacia proteínas permite muchos tipos de estudios que de otra manera serían extremadamente difíciles, como:

Futuro

La expansión del código genético está todavía en sus inicios. La metodología actual utiliza sólo un aminoácido no estándar a la vez, cuando lo ideal sería utilizar varios. De hecho, el grupo de Jason Chin ha batido recientemente el récord de una cepa de E. coli recodificada genéticamente que puede incorporar simultáneamente hasta cuatro aminoácidos no naturales. [73] Además, se ha desarrollado un software que permite la combinación de ribosomas ortogonales y pares ARNt/RS no naturales para mejorar el rendimiento y la fidelidad de las proteínas. [73]

Genoma sintético recodificado

Una forma de lograr la codificación de múltiples aminoácidos no naturales es sintetizando un genoma reescrito. [74] En 2010, a un costo de $40 millones, se construyó un organismo, Mycoplasma laboratorium , que estaba controlado por un genoma sintético, pero no recodificado. [75] El primer organismo genéticamente recodificado fue creado por una colaboración entre los laboratorios de George Church y Farren Isaacs, cuando el tipo salvaje E. coli MG1655 fue recodificado de tal manera que los 321 codones de parada conocidos (UAG) fueron sustituidos con codones UAA sinónimos y el factor de liberación 1 fue eliminado para eliminar la interacción con el codón de parada exógeno y mejorar la síntesis de proteínas no naturales. [28] En 2019, se creó Escherichia coli Syn61, con un genoma recodificado de 4 megabases que consta de solo 61 codones en lugar de los 64 naturales . [3] [2] Además de la eliminación del uso de codones raros, es necesario aumentar la especificidad del sistema ya que muchos ARNt reconocen varios codones [74]

Alfabeto genético ampliado

Otro enfoque es ampliar el número de nucleobases para aumentar la capacidad de codificación.

Un par de bases no naturales (UBP) es una subunidad diseñada (o nucleobase ) de ADN que se crea en un laboratorio y no se produce en la naturaleza. Una demostración de UBP se logró in vitro por el grupo de Ichiro Hirao en el instituto RIKEN en Japón. En 2002, desarrollaron un par de bases no naturales entre 2-amino-8-(2-tienil)purina (s) y piridina-2-ona (y) que funciona in vitro en la transcripción y traducción para la incorporación específica del sitio de aminoácidos no estándar en proteínas. [76] En 2006, crearon 7-(2-tienil)imidazo[4,5-b]piridina (Ds) y pirrol-2-carbaldehído (Pa) como un tercer par de bases para la replicación y la transcripción. [77] Posteriormente, se descubrió que Ds y 4-[3-(6-aminohexanamido)-1-propinil]-2-nitropirrol (Px) eran un par de alta fidelidad en la amplificación por PCR. [78] [79] En 2013, aplicaron el par Ds-Px a la generación de aptámeros de ADN mediante selección in vitro (SELEX) y demostraron que la expansión del alfabeto genético aumenta significativamente las afinidades de los aptámeros de ADN con las proteínas objetivo. [80]

En 2012, un grupo de científicos estadounidenses dirigido por Floyd Romesberg, un biólogo químico del Instituto de Investigación Scripps en San Diego, California, publicó que su equipo diseñó un par de bases no naturales (UBP). [81] Los dos nuevos nucleótidos artificiales o Unnatural Base Pair (UBP) se denominaron " d5SICS " y " dNaM ". Más técnicamente, estos nucleótidos artificiales que llevan nucleobases hidrófobas , presentan dos anillos aromáticos fusionados que forman un complejo (d5SICS–dNaM) o par de bases en el ADN. [82] [83] En 2014, el mismo equipo del Instituto de Investigación Scripps informó que sintetizaron un tramo de ADN circular conocido como plásmido que contiene pares de bases TA y CG naturales junto con el UBP de mejor rendimiento que había diseñado el laboratorio de Romesberg, y lo insertaron en células de la bacteria común E. coli que replicó con éxito los pares de bases no naturales a través de múltiples generaciones. [84] Este es el primer ejemplo conocido de un organismo vivo que transmite un código genético ampliado a generaciones posteriores. [82] [85] Esto se logró en parte mediante la adición de un gen de algas de apoyo que expresa un transportador de trifosfato de nucleótidos que importa de manera eficiente los trifosfatos de d5SICSTP y dNaMTP a las bacterias E. coli . [82] Luego, las vías de replicación bacteriana natural los utilizan para replicar con precisión el plásmido que contiene d5SICS–dNaM.

La incorporación exitosa de un tercer par de bases en un microorganismo vivo es un avance significativo hacia el objetivo de expandir en gran medida el número de aminoácidos que pueden ser codificados por el ADN, expandiendo así el potencial de los organismos vivos para producir nuevas proteínas . [84] Las cadenas artificiales de ADN aún no codifican nada, pero los científicos especulan que podrían ser diseñadas para fabricar nuevas proteínas que podrían tener usos industriales o farmacéuticos. [86]

En mayo de 2014, los investigadores anunciaron que habían introducido con éxito dos nuevos nucleótidos artificiales en el ADN bacteriano y, al incluir nucleótidos artificiales individuales en los medios de cultivo, pudieron inducir la amplificación de los plásmidos que contenían los nucleótidos artificiales por un factor de 2 x 10 7 (24 duplicaciones); no crearon ARNm ni proteínas capaces de utilizar los nucleótidos artificiales. [82] [87] [88] [89]

Métodos relacionados

Método de incorporación de presión selectiva (SPI) para la producción de aloproteínas

Se han realizado muchos estudios que han producido proteínas con aminoácidos no estándar, pero que no alteran el código genético. Estas proteínas, llamadas aloproteínas , se obtienen incubando células con un aminoácido no natural en ausencia de un aminoácido codificado similar para que el primero se incorpore a la proteína en lugar del segundo, por ejemplo, el ácido L -2-aminohexanoico (Ahx) en lugar de la metionina (Met). [90]

Estos estudios se basan en la actividad promiscua natural de la aminoacil ARNt sintetasa para añadir a su ARNt objetivo un aminoácido no natural (es decir, análogo) similar al sustrato natural, por ejemplo, la metionil-ARNt sintetasa confundiendo isoleucina con metionina. [91] En la cristalografía de proteínas, por ejemplo, la adición de selenometionina al medio de un cultivo de una cepa auxotrófica de metionina da como resultado proteínas que contienen selenometionina en lugar de metionina ( es decir, dispersión anómala de múltiples longitudes de onda por alguna razón). [92] Otro ejemplo es que se añaden fotoleucina y fotometionina en lugar de leucina y metionina para marcar de forma cruzada la proteína. [93] De forma similar, algunos hongos tolerantes al telurio pueden incorporar telurocisteína y telurometionina en su proteína en lugar de cisteína y metionina. [94] El objetivo de expandir el código genético es más radical ya que no reemplaza un aminoácido, sino que agrega uno o más al código. Por otro lado, los reemplazos a nivel de proteoma se realizan de manera más eficiente mediante sustituciones globales de aminoácidos. Por ejemplo, se han intentado sustituciones globales a nivel de proteoma de aminoácidos naturales con análogos fluorados en E. coli [95] y B. subtilis . [96] Una sustitución completa de triptófano con tienopirrol-alanina en respuesta a 20899 codones UGG en E. coli fue reportada en 2015 por Budisa y Söll . [97] Además, muchos fenómenos biológicos, como el plegamiento y la estabilidad de las proteínas, se basan en efectos sinérgicos en muchas posiciones en la secuencia de la proteína. [98]

En este contexto, el método SPI genera variantes de proteínas recombinantes o aloproteínas directamente mediante la sustitución de aminoácidos naturales con contrapartes no naturales. [99] Un huésped de expresión auxotrófica de aminoácidos se complementa con un análogo de aminoácido durante la expresión de la proteína objetivo. [100] Este enfoque evita las trampas de los métodos basados ​​en la supresión [101] y es superior a él en términos de eficiencia, reproducibilidad y una configuración experimental extremadamente simple. [102] Numerosos estudios demostraron cómo la sustitución global de aminoácidos canónicos con varios análogos isostéricos causó perturbaciones estructurales mínimas pero cambios dramáticos en la termodinámica, [103] plegamiento, [104] agregación [105] propiedades espectrales [106] [107] y actividad enzimática. [108]

in vitrosíntesis

La expansión del código genético descrita anteriormente se produce in vivo . Una alternativa es el cambio de codificación en experimentos de traducción in vitro . Esto requiere la eliminación de todos los ARNt y la reintroducción selectiva de ciertos ARNt aminoacilados, algunos de ellos químicamente aminoacilados. [109]

Síntesis química

Existen varias técnicas para producir péptidos químicamente, generalmente mediante química de protección en fase sólida. Esto significa que cualquier aminoácido (protegido) puede agregarse a la secuencia naciente. [ cita requerida ]

En noviembre de 2017, un equipo del Instituto de Investigación Scripps informó haber construido un genoma de la bacteria E. coli semisintético utilizando seis nucleótidos diferentes (en comparación con los cuatro que se encuentran en la naturaleza). Las dos "letras" adicionales forman un tercer par de bases no natural. Los organismos resultantes pudieron prosperar y sintetizar proteínas utilizando "aminoácidos no naturales". [110] [111] El par de bases no natural utilizado es dNaM –dTPT3. [111] Este par de bases no natural se ha demostrado anteriormente, [112] [113] pero este es el primer informe de transcripción y traducción de proteínas utilizando un par de bases no natural.

Véase también

Referencias

  1. ^ Xie J, Schultz PG (diciembre de 2005). "Adición de aminoácidos al repertorio genético". Current Opinion in Chemical Biology . 9 (6): 548–54. doi :10.1016/j.cbpa.2005.10.011. PMID  16260173.
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