La disrupción celular es un método o proceso para liberar moléculas biológicas desde el interior de una célula .
La producción de moléculas biológicamente interesantes mediante métodos de clonación y cultivo permite el estudio y la fabricación de moléculas relevantes. A excepción de las moléculas excretadas, las células que producen moléculas de interés deben ser alteradas. Esta página analiza varios métodos. Otro método de alteración se llama destechado celular .
Un método mecánico común a escala de laboratorio para la alteración celular utiliza perlas de vidrio , cerámica o acero , de 0,1 a 2 mm (0,004 a 0,08 pulgadas) de diámetro, mezcladas con una muestra suspendida en una solución acuosa . Desarrollado por primera vez por Tim Hopkins a fines de la década de 1970, la mezcla de muestra y perlas se somete a un alto nivel de agitación mediante agitación o agitación. Las perlas chocan con la muestra celular, abriendo la célula para liberar los componentes intracelulares . A diferencia de otros métodos, el cizallamiento mecánico es moderado durante la homogeneización , lo que da como resultado excelentes preparaciones de membrana o subcelulares. El método, a menudo llamado "golpe de cuentas", funciona bien para todo tipo de material celular, desde esporas hasta tejidos animales y vegetales . Es el método de lisis de levadura más utilizado y puede producir una rotura de más del 50% (hasta un 95%). [1] Tiene la ventaja sobre otros métodos mecánicos de alteración celular de poder alterar muestras de tamaño muy pequeño, procesar muchas muestras a la vez sin problemas de contaminación cruzada y no libera aerosoles potencialmente dañinos en el proceso.
En el ejemplo más simple del método, se agrega un volumen igual de perlas a una suspensión de células o tejido en un tubo de ensayo y la muestra se mezcla vigorosamente en un mezclador vórtex común de laboratorio . Si bien los tiempos de procesamiento son lentos, de 3 a 10 veces más que en las máquinas agitadoras especiales , funciona bien para células que se rompen fácilmente y es económico.
El éxito del batido de perlas depende no sólo de las características de diseño de la máquina agitadora (que tienen en cuenta la frecuencia de las oscilaciones de la agitación, el alcance o la distancia de la agitación, la orientación de la agitación y la orientación del vial), sino también de la selección del tamaño correcto de las perlas (0,1–6 mm (0,004 –0,2 pulgadas) de diámetro), composición de las perlas (vidrio, cerámica, acero) y carga de las perlas en el vial .
En la mayoría de los laboratorios, el batido de perlas se realiza en lotes de uno a veinticuatro viales de plástico sellados o tubos de centrífuga . La muestra y las diminutas perlas se agitan a unas 2.000 oscilaciones por minuto en agitadores alternativos especialmente diseñados y accionados por motores eléctricos de alta potencia . La destrucción celular se completa en 1 a 3 minutos de agitación. Se logran tasas de alteración celular significativamente más rápidas con una variación del batidor de cuentas llamada SoniBeast . A diferencia de las máquinas convencionales, agita las perlas mediante un movimiento de vórtice de 20.000 oscilaciones por minuto. Las máquinas batidoras de perlas más grandes que sostienen placas de microtitulación de pocillos profundos también acortan los tiempos de proceso, al igual que los dispensadores de perlas diseñados para cargar rápidamente perlas en múltiples viales o microplacas. [2] [3] También se encuentran disponibles viales y microplacas precargados.
Todas las máquinas batidoras de perlas de alta energía calientan la muestra a unos 10 grados por minuto. Esto se debe a las colisiones por fricción de las perlas durante la homogeneización. Puede ser necesario enfriar la muestra durante o después del batido de las perlas para evitar daños a las proteínas sensibles al calor, como las enzimas. El calentamiento de la muestra se puede controlar batiendo las perlas durante intervalos de tiempo cortos con enfriamiento en hielo entre cada intervalo, procesando los viales en soportes de aluminio preenfriados o haciendo circular refrigerante gaseoso a través de la máquina durante el batido de las perlas.
Una configuración diferente del batidor de perlas, adecuada para volúmenes de muestra más grandes, utiliza un rotor de fluorocarbono giratorio dentro de una cámara de 15, 50 o 200 ml para agitar las perlas. En esta configuración, la cámara puede estar rodeada por una camisa de refrigeración estática. Utilizando esta misma configuración de rotor/cámara, se encuentran disponibles grandes máquinas comerciales para procesar muchos litros de suspensión celular . Actualmente, estas máquinas se limitan a procesar organismos unicelulares como levaduras, algas y bacterias .
Las muestras con una matriz extracelular resistente, como el tejido conectivo animal, algunas muestras de biopsia de tumores, tejido venoso, cartílago, semillas, etc., se reducen a un polvo fino mediante pulverización por impacto a temperaturas de nitrógeno líquido. Esta técnica, conocida como criopulverización, se basa en el hecho de que las muestras biológicas que contienen una fracción importante de agua se vuelven quebradizas a temperaturas extremadamente frías. Esta técnica fue descrita por primera vez por Smucker y Pfister en 1975, quienes la denominaron crioimpactación. Los autores demostraron que las células se rompen eficazmente con este método, confirmando mediante microscopía electrónica y de fase que los planos de ruptura atraviesan las paredes celulares y las membranas citoplasmáticas. [4]
La técnica se puede realizar utilizando un mortero enfriado a temperaturas de nitrógeno líquido, pero el uso de este aparato clásico es laborioso y la pérdida de muestra suele ser una preocupación. También se encuentran disponibles para este propósito pulverizadores especializados de acero inoxidable, conocidos genéricamente como pulverizadores de tejidos. Requieren menos esfuerzo manual, ofrecen una buena recuperación de muestras y son fáciles de limpiar entre muestras. Las ventajas de esta técnica son mayores rendimientos de proteínas y ácidos nucleicos a partir de muestras pequeñas de tejido duro, especialmente cuando se utiliza como paso preliminar a los métodos de alteración celular mecánicos o químicos/solventes mencionados anteriormente.
Desde la década de 1940, la alta presión se ha utilizado como método de disrupción celular, sobre todo por la French Pressure Cell Press , o French Press para abreviar. Este método fue desarrollado por Charles Stacy French y utiliza alta presión para forzar a las células a través de un orificio estrecho, lo que hace que las células se lisan debido a las fuerzas de corte experimentadas a través del diferencial de presión. [5] [6] Si bien las prensas francesas se han convertido en un elemento básico en muchos laboratorios de microbiología, su producción se ha interrumpido en gran medida, lo que ha llevado a un resurgimiento de aplicaciones alternativas de tecnología similar.
Los disruptores de células físicos modernos suelen funcionar mediante presión neumática o hidráulica. Aunque las máquinas neumáticas suelen tener un costo más bajo, su rendimiento puede ser poco confiable debido a las variaciones en la presión de procesamiento a lo largo de la carrera de la bomba de aire. En general, se considera que las máquinas hidráulicas ofrecen una capacidad de lisis superior, especialmente cuando se procesan muestras más difíciles de romper, como levaduras o bacterias Gram positivas , debido a su capacidad para mantener una presión constante durante toda la carrera del pistón. Como la prensa francesa, que funciona con presión hidráulica, es capaz de lisis de más del 90% de los tipos de células más utilizados, a menudo se considera el estándar de oro en el rendimiento de lisis y las máquinas modernas a menudo se comparan con ella no solo en términos de lisis. eficiencia sino también en términos de seguridad y facilidad de uso. Algunos fabricantes también están intentando mejorar el diseño tradicional alterando propiedades dentro de estas máquinas además de la presión que impulsa la muestra a través del orificio. Un ejemplo de ello es Constant Systems, que recientemente ha demostrado que sus disruptores celulares no sólo igualan el rendimiento de una prensa francesa tradicional, sino que también se esfuerzan por lograr los mismos resultados con una potencia mucho menor. [7]
Tecnología de ciclo de presión ("PCT"). PCT es una plataforma tecnológica patentada que utiliza ciclos alternos de presión hidrostática entre niveles ambientales y ultra altos (hasta 90 000 psi) para controlar de forma segura, conveniente y reproducible las acciones de las moléculas en muestras biológicas, por ejemplo, la ruptura (lisis) de células y tejidos de origen humano, animal, vegetal y microbiano, y la inactivación de patógenos. Los sistemas mejorados con PCT (instrumentos y consumibles) abordan algunos problemas desafiantes inherentes a la preparación de muestras biológicas. Las ventajas de la PCT incluyen: (a) extracción y recuperación de más proteínas de membrana, (b) digestión mejorada de proteínas, (c) lisis diferencial en una base de muestra mixta, (d) inactivación de patógenos, (e) mayor detección de ADN y (f) Control exquisito del proceso de preparación de muestras. [8]
El método Microfluidizer utilizado para la disrupción celular influye fuertemente en las propiedades fisicoquímicas de la suspensión celular lisada , como el tamaño de las partículas, la viscosidad, el rendimiento de proteínas y la actividad enzimática. En los últimos años, el método Microfluidizer ha ganado popularidad en la disrupción celular debido a su facilidad de uso y eficiencia para alterar muchos tipos diferentes de células. La tecnología Microfluidizer obtuvo la licencia de una empresa llamada Arthur D. Little y se desarrolló y utilizó por primera vez en la década de 1980, inicialmente como una herramienta para la creación de liposomas . Desde entonces, se ha utilizado en otras aplicaciones, como nanoemulsiones de alteración celular y reducción del tamaño de partículas sólidas, entre otras.
Mediante el uso de microcanales con geometría fija y una bomba intensificadora, se generan altas tasas de cizallamiento que rompen las células. Este método de lisis celular puede producir la rotura de más del 90% de las células de E. coli. [9]
Muchas proteínas son extremadamente sensibles a la temperatura y, en muchos casos, pueden empezar a desnaturalizarse a temperaturas de sólo 4 grados centígrados. Dentro de los microcanales, las temperaturas superan los 4 grados centígrados, pero la máquina está diseñada para enfriarse rápidamente, de modo que el tiempo que las células están expuestas a temperaturas elevadas es extremadamente corto ( tiempo de residencia de 25 ms a 40 ms). Debido a este control eficaz de la temperatura, el microfluidizador produce niveles más altos de proteínas y enzimas activas que otros métodos mecánicos cuando las proteínas son sensibles a la temperatura. [10]
También se observan a menudo cambios de viscosidad cuando se alteran las células. Si la viscosidad de la suspensión celular es alta, puede dificultar bastante el manejo posterior, como la filtración y el pipeteo preciso. Los cambios de viscosidad observados con un microfluidizador son relativamente bajos y disminuyen con más pasos adicionales a través de la máquina. [11]
A diferencia de otros métodos de ruptura mecánica, el Microfluidizador rompe las membranas celulares de manera eficiente pero suave, lo que da como resultado fragmentos de pared celular relativamente grandes (450 nm) y, por lo tanto, facilita la separación del contenido celular. Esto puede conducir a tiempos de filtración más cortos y una mejor separación por centrifugación. [12]
La tecnología de microfluidizadores escala desde un mililitro hasta miles de litros.
Para la descompresión del nitrógeno, primero se disuelven grandes cantidades de nitrógeno en la celda a alta presión dentro de un recipiente a presión adecuado . Luego, cuando la presión del gas se libera repentinamente, el nitrógeno sale de la solución en forma de burbujas en expansión que estiran las membranas de cada célula hasta que se rompen y liberan el contenido de la célula.
La descompresión de nitrógeno protege más las enzimas y los orgánulos que los métodos de homogeneización mecánicos y ultrasónicos y se compara favorablemente con la acción disruptiva controlada obtenida en un homogeneizador de mortero de vidrio y PTFE. [13] Mientras que otros métodos disruptivos dependen de la fricción o de una acción de corte mecánico que genera calor, el procedimiento de descompresión del nitrógeno va acompañado de una expansión adiabática que enfría la muestra en lugar de calentarla.
El manto de gas nitrógeno inerte que satura la suspensión celular y el homogeneizado ofrece protección contra la oxidación de los componentes celulares. Aunque en esta técnica se han utilizado otros gases: dióxido de carbono , óxido nitroso , monóxido de carbono y aire comprimido, se prefiere el nitrógeno por su naturaleza no reactiva y porque no altera el pH del medio de suspensión. Además, se prefiere el nitrógeno porque generalmente está disponible a bajo coste y a presiones adecuadas para este procedimiento.
Una vez liberadas, las sustancias subcelulares no están expuestas a un desgaste continuo que podría desnaturalizar la muestra o producir daños no deseados. No es necesario estar atento a un pico entre la actividad enzimática y el porcentaje de alteración. Dado que se generan burbujas de nitrógeno dentro de cada celda, la misma fuerza disruptiva se aplica uniformemente en toda la muestra, asegurando así una uniformidad inusual en el producto. Se pueden producir homogeneizados libres de células.
La técnica se utiliza para homogeneizar células y tejidos, liberar orgánulos intactos , preparar membranas celulares , liberar bioquímicos lábiles y producir homogeneizados uniformes y repetibles sin someter la muestra a estrés químico o físico extremo.
El método es particularmente adecuado para el tratamiento de células de mamíferos y otras células unidas a membranas. [14] También se ha utilizado con éxito para tratar células vegetales , para liberar virus de huevos fertilizados y para tratar bacterias frágiles . No se recomienda para células bacterianas no tratadas. Las levaduras , los hongos , las esporas y otros materiales con paredes celulares duras no responden bien a este método.