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Validación de estructura

Concepto de validación de estructura: modelo de una proteína (cada bola es un átomo) y región ampliada con datos de densidad electrónica y 3 banderas brillantes para problemas

La validación de la estructura macromolecular es el proceso de evaluación de la fiabilidad de los modelos atómicos tridimensionales de moléculas biológicas de gran tamaño, como las proteínas y los ácidos nucleicos . Estos modelos, que proporcionan coordenadas tridimensionales de cada átomo de la molécula (véase el ejemplo de la imagen), proceden de experimentos de biología estructural , como la cristalografía de rayos X [1] o la resonancia magnética nuclear (RMN). [2] La validación tiene tres aspectos: 1) comprobar la validez de las miles o millones de mediciones del experimento; 2) comprobar la coherencia del modelo atómico con esos datos experimentales; y 3) comprobar la coherencia del modelo con las propiedades físicas y químicas conocidas.

Las proteínas y los ácidos nucleicos son los caballos de batalla de la biología, ya que proporcionan las reacciones químicas, la organización estructural, el crecimiento, la movilidad, la reproducción y la sensibilidad ambiental necesarias. Las estructuras tridimensionales detalladas de las moléculas y los cambios en esas estructuras son esenciales para sus funciones biológicas. Para comprender y controlar esas funciones, necesitamos un conocimiento preciso de los modelos que representan esas estructuras, incluidos sus numerosos puntos fuertes y sus ocasionales debilidades.

Los usuarios finales de los modelos macromoleculares incluyen médicos, profesores y estudiantes, así como los propios biólogos estructurales, editores y evaluadores de revistas científicas , experimentadores que estudian las macromoléculas mediante otras técnicas y teóricos y bioinformáticos que estudian propiedades más generales de las moléculas biológicas. Sus intereses y requisitos varían, pero todos se benefician enormemente de una comprensión global y local de la fiabilidad de los modelos.

Resumen histórico

La cristalografía macromolecular fue precedida por el campo más antiguo de la cristalografía de rayos X de moléculas pequeñas (para estructuras con menos de unos pocos cientos de átomos). Los datos de difracción de moléculas pequeñas se extienden a una resolución mucho mayor que la factible para las macromoléculas y tienen una relación matemática muy clara entre los datos y el modelo atómico. El residuo, o factor R, mide la concordancia entre los datos experimentales y los valores retrocalculados a partir del modelo atómico. Para una estructura de molécula pequeña bien determinada, el factor R es casi tan pequeño como la incertidumbre en los datos experimentales (bastante por debajo del 5%). Por lo tanto, esa prueba por sí sola proporciona la mayor parte de la validación necesaria, pero una serie de comprobaciones adicionales de consistencia y metodología se realizan mediante software automatizado [3] como requisito para los artículos sobre estructuras cristalinas de moléculas pequeñas enviados a las revistas de la Unión Internacional de Cristalografía (IUCr), como Acta Crystallographica sección B o C. Las coordenadas atómicas de estas estructuras de moléculas pequeñas se archivan y se accede a ellas a través de la Base de datos estructural de Cambridge (CSD) [4] o la Base de datos abierta de cristalografía (COD). [5]

El primer software de validación macromolecular se desarrolló alrededor de 1990 para proteínas. Incluía validación cruzada Rfree para la correspondencia entre modelos y datos, [6] parámetros de longitud y ángulo de enlace para geometría covalente, [7] y criterios conformacionales de cadena lateral y cadena principal. [8] [9] [10] Para las estructuras macromoleculares, los modelos atómicos se depositan en el Protein Data Bank (PDB), que sigue siendo el único archivo de estos datos. El PDB se estableció en la década de 1970 en el Laboratorio Nacional de Brookhaven , [11] se trasladó en 2000 al RCSB Archivado 2008-08-28 en Wayback Machine (Colaboración de investigación para la biología estructural) centrado en Rutgers , [12] y se expandió en 2003 para convertirse en el wwPDB (Banco de datos de proteínas mundial), [13] con sitios de acceso agregados en Europa ([1]) y Asia ([2]), y con datos de RMN manejados en el BioMagResBank (BMRB) en Wisconsin.

La validación se convirtió rápidamente en un estándar en el campo [14] , y a continuación se describen los avances posteriores. *Obviamente, necesita expansión*

El 1 de febrero de 2008 se dio un gran impulso a la aplicabilidad de la validación integral tanto para rayos X como para RMN, cuando el Banco Mundial de Datos de Proteínas (wwPDB) hizo obligatoria la deposición de datos experimentales junto con las coordenadas atómicas. Desde 2012, se han estado adoptando formas sólidas de validación para la deposición de wwPDB a partir de las recomendaciones de los comités del Grupo de Trabajo de Validación de wwPDB para cristalografía de rayos X , [15] para RMN, [16] para SAXS ( dispersión de rayos X de ángulo pequeño ) y para crioEM ( criomicroscopía electrónica ). [17]

Etapas de la validación

Las validaciones se pueden dividir en tres etapas: la validación de los datos brutos recopilados (validación de datos), la interpretación de los datos en el modelo atómico (validación de modelo a datos) y, por último, la validación del modelo en sí. Si bien los dos primeros pasos son específicos de la técnica utilizada, la validación de la disposición de los átomos en el modelo final no lo es.

Validación del modelo

Geometría

[7] [18] [19]

Conformación (diédricos): proteínas y ARN

Se ha demostrado que los ángulos diedros de la cadena principal y de la cadena lateral de proteínas y ARN tienen combinaciones específicas de ángulos que están permitidos (o prohibidos). Para los diedros de la cadena principal de proteínas (φ, ψ), esto se ha abordado mediante el legendario diagrama de Ramachandran, mientras que para los diedros de la cadena lateral (χ), se debe consultar la biblioteca de rotámeros dependientes de la cadena principal de Dunbrack . [20]

Aunque las estructuras de ARNm son generalmente de vida corta y monocatenarias, hay una gran cantidad de ARN no codificantes con diferentes plegamientos secundarios y terciarios (ARNt, ARNr, etc.) que contienen una preponderancia de los pares de bases canónicos de Watson-Crick (WC), junto con un número significativo de pares de bases que no son de Watson-Crick (NWC), para los cuales dichos ARN también califican para la validación estructural regular que se aplica a las hélices de ácidos nucleicos. La práctica estándar es analizar los parámetros geométricos intra- (Transnacional: Desplazamiento, Deslizamiento, Elevación; Rotacional: Inclinación, Giro, Giro) e inter-pares de bases (Transnacional: Cizallamiento, Escalonamiento, Estiramiento; Rotacional: Hebilla, Hélice, Apertura), ya sea dentro o fuera del rango con respecto a sus valores sugeridos. [21] [22] Estos parámetros describen las orientaciones relativas de las dos bases pareadas entre sí en dos cadenas (intra) junto con las de los dos pares de bases apilados (inter) entre sí y, por lo tanto, juntos, sirven para validar las estructuras de los ácidos nucleicos en general. Dado que las hélices de ARN tienen una longitud pequeña (promedio: 10-20 pb), se ha descubierto que el uso del potencial de superficie electrostático como parámetro de validación [23] es beneficioso, en particular para fines de modelado.

Empaquetamiento y electrostática: proteínas globulares

En el caso de las proteínas globulares, se ha demostrado que el empaquetamiento atómico interior (que surge de interacciones locales de corto alcance) de las cadenas laterales [24] [25] [26] [27] es fundamental para la estabilización estructural del pliegue proteico. Por otro lado, también se ha demostrado que la armonía electrostática (no local, de largo alcance) del pliegue general [28] es esencial para su estabilización. Las anomalías de empaquetamiento incluyen choques estéricos, [29] contactos cortos, [27] agujeros [30] y cavidades [31], mientras que la desarmonía electrostática [28] [32] se refiere a cargas parciales desequilibradas en el núcleo proteico (particularmente relevante para los interiores proteicos diseñados). Mientras que el puntaje de choque de Molprobity identifica los choques estéricos con una resolución muy alta, el gráfico de complementariedad combina anomalías de empaquetamiento con desequilibrio electrostático de cadenas laterales y señales para uno o ambos.

Carbohidratos

Diagrama 2D de un N-glicano unido a un fragmento de anticuerpo en la estructura con el código de acceso PDB ' 4BYH ​'. Este diagrama, que se ha generado con Privateer, [33] sigue la nomenclatura de símbolos estándar [34] e incluye, en su formato svg original, anotaciones que contienen información de validación, incluida la conformación del anillo y los tipos de monosacáridos detectados.

La naturaleza ramificada y cíclica de los carbohidratos plantea problemas particulares a las herramientas de validación de estructuras. [35] A resoluciones más altas, es posible determinar la secuencia/estructura de oligo- y polisacáridos, tanto como modificaciones covalentes como ligandos. Sin embargo, a resoluciones más bajas (típicamente inferiores a 2,0 Å), las secuencias/estructuras deberían coincidir con las estructuras conocidas o estar respaldadas por técnicas complementarias como la espectrometría de masas. [36] Además, los monosacáridos tienen claras preferencias conformacionales (los anillos saturados se encuentran típicamente en conformaciones de silla), [37] pero los errores introducidos durante la construcción y/o refinamiento del modelo (quiralidad o distancia de enlace incorrecta, o elección incorrecta del modelo - ver [38] para recomendaciones sobre la construcción y refinamiento del modelo de carbohidratos y [39] [40] [41] para revisiones sobre errores generales en las estructuras de carbohidratos) pueden sacar sus modelos atómicos del estado de baja energía más probable. Alrededor del 20% de las estructuras de carbohidratos depositadas están en una conformación de mayor energía no justificada por los datos estructurales (medidos utilizando el coeficiente de correlación del espacio real). [42]

En glycosciences.de se encuentran disponibles varios servicios web de validación de carbohidratos (incluidas las comprobaciones de nomenclatura y de enlaces por parte de pdb-care, [43] y la validación cruzada con datos de espectrometría de masas mediante el uso de GlycanBuilder), mientras que la suite CCP4 actualmente distribuye Privateer, [33] que es una herramienta que está integrada en el proceso de construcción y refinamiento del modelo. Privateer puede comprobar la estereoquímica y regioquímica, la conformación y fruncimiento de los anillos, las torsiones de enlace y la correlación en el espacio real frente a la densidad de omisión positiva, generando restricciones de torsión aperiódicas en los enlaces de los anillos, que pueden ser utilizadas por cualquier software de refinamiento para mantener la conformación de energía mínima del monosacárido. [33]

Privateer también genera diagramas SVG bidimensionales escalables de acuerdo con la nomenclatura de símbolos estándar de Essentials of Glycobiology [34] que contiene toda la información de validación como anotaciones de información sobre herramientas (ver figura). Esta funcionalidad está actualmente integrada en otros programas CCP4, como el programa de gráficos moleculares CCP4mg (a través de la representación 3D de Glycoblocks , [44] que se ajusta a la nomenclatura de símbolos estándar [34] ) y la interfaz gráfica de la suite, CCP4i2.

Validación para cristalografía

Consideraciones generales

Criterios globales vs. criterios locales

Muchos criterios de evaluación se aplican globalmente a una estructura experimental completa, en particular la resolución , la anisotropía o incompletitud de los datos y el residuo o factor R que mide la correspondencia general entre el modelo y los datos (ver más abajo). Estos criterios ayudan al usuario a elegir la más precisa entre las entradas relacionadas del Protein Data Bank para responder a sus preguntas. Otros criterios se aplican a residuos individuales o regiones locales en la estructura 3D, como el ajuste al mapa de densidad electrónica local o los choques estéricos entre átomos. Estos son especialmente valiosos para el biólogo estructural para realizar mejoras en el modelo, y para el usuario para evaluar la fiabilidad de ese modelo en torno al lugar que le interesa, como un sitio de actividad enzimática o de unión de fármacos. Ambos tipos de medidas son muy útiles, pero aunque los criterios globales son más fáciles de enunciar o publicar, los criterios locales son los que más contribuyen a la precisión científica y la relevancia biológica. Como se expresa en el libro de texto de Rupp, "Sólo la validación local, que incluye la evaluación tanto de la geometría como de la densidad electrónica, puede dar una imagen precisa de la fiabilidad del modelo de estructura o de cualquier hipótesis basada en características locales del modelo". [45]

¿Qué se puede ver en las estructuras cristalinas macromoleculares de baja y alta resolución?

Relación con la resolución y el factor B

Validación de datos

Factores de estructura

Hermanamiento

Validación de modelo a datos

Residuos y Rfree

Correlación en el espacio real

Mejora mediante la corrección de problemas diagnosticados

En resonancia magnética nuclear

Validación de datos: desplazamientos químicos, NOE, RDC

AVS
El conjunto de validación de asignaciones (AVS) verifica la lista de desplazamientos químicos en formato BioMagResBank (BMRB) para detectar problemas. [46]
PSVS
Servidor de validación de estructura de proteínas en el NESG basado en estadísticas de recuperación de información [47]
PROCESO
PROSESS (Protein Structure Evaluation Suite & Server) es un nuevo servidor web que ofrece una evaluación de modelos estructurales de proteínas mediante desplazamientos químicos de RMN, así como NOE, parámetros geométricos y basados ​​en conocimiento.
LACS
El análisis lineal de desplazamientos químicos se utiliza para la referencia absoluta de los datos de desplazamiento químico.

Validación de modelo a datos

TALOS+ . Predice los ángulos de torsión de la estructura de la proteína a partir de datos de desplazamiento químico. Se utiliza con frecuencia para generar restricciones adicionales aplicadas a un modelo de estructura durante el refinamiento.

Validación del modelo: como arriba

Conjunto estructural de RMN para el archivo PDB 2K5D, con estructura bien definida para las cadenas beta (flechas) y regiones indefinidas, presumiblemente altamente móviles, para el bucle naranja y el extremo N azul

Dinámica: núcleo vs. bucles, colas y dominios móviles

Una de las necesidades críticas para la validación de conjuntos estructurales de RMN es distinguir las regiones bien determinadas (aquellas que tienen datos experimentales) de las regiones que son altamente móviles y/o no tienen datos observados. Existen varios métodos actuales o propuestos para hacer esta distinción, como el índice de bobina aleatoria , pero hasta ahora la comunidad de RMN no ha estandarizado uno.

Software y sitios web

En crio-EM

La Cyro-EM presenta desafíos especiales para los constructores de modelos ya que la densidad electrónica observada con frecuencia es insuficiente para resolver átomos individuales, lo que genera una mayor probabilidad de errores.

Se pueden utilizar herramientas de validación basadas en geometría similares a las que se utilizan en la cristalografía de rayos X para destacar opciones de modelado inverosímiles y guiar al modelador hacia estructuras más parecidas a las nativas. El método CaBLAM, que solo utiliza átomos de Cα, [48] es adecuado para estructuras de baja resolución de cyro-EM. [49]

Se ha formulado una forma de calcular el mapa de densidad de diferencia para la crio-EM. [50] [51] También está disponible la validación cruzada utilizando un mapa "libre", comparable al uso de un factor R libre . [52] [53] Otros métodos para comprobar el ajuste del mapa modelo incluyen coeficientes de correlación, FSC del mapa modelo, [54] mapas de confianza, CryoEF (verificación de sesgo de orientación) y TEMPy SMOC. [51]

En SAXS

La SAXS (dispersión de rayos X de ángulo pequeño) es un área de determinación de estructuras en rápido crecimiento, tanto como fuente de estructura tridimensional aproximada para casos iniciales o difíciles como componente de la determinación de estructuras mediante métodos híbridos cuando se combina con RMN, EM, cristalografía, reticulación o información computacional. Existe un gran interés en el desarrollo de estándares de validación confiables para la interpretación de datos SAXS y para la calidad de los modelos resultantes, pero aún no existen métodos establecidos de uso general. Tres pasos recientes en esta dirección son la creación de un comité del Grupo de trabajo de validación de dispersión de ángulo pequeño por parte del banco de datos de proteínas mundial y su informe inicial, [55] un conjunto de estándares sugeridos para la inclusión de datos en publicaciones, [56] y una propuesta inicial de criterios derivados estadísticamente para la evaluación de calidad automatizada. [57]

Para biología computacional

Es difícil hacer una validación significativa de un modelo macromolecular individual, puramente computacional, en ausencia de datos experimentales para esa molécula, porque el modelo con la mejor geometría y puntuación conformacional puede no ser el más cercano a la respuesta correcta. Por lo tanto, gran parte del énfasis en la validación del modelado computacional está en la evaluación de los métodos. Para evitar sesgos e ilusiones, se han organizado competiciones de predicción doble ciego, cuyo ejemplo original (que se lleva a cabo cada 2 años desde 1994) es CASP (Evaluación crítica de la predicción de la estructura) para evaluar las predicciones de la estructura de proteínas 3D para estructuras cristalográficas o de RMN recientemente resueltas que se mantienen en confidencialidad hasta el final de la competición relevante. [58] El criterio principal para la evaluación CASP es una puntuación ponderada llamada GDT-TS para la coincidencia de las posiciones Calpha entre los modelos predichos y experimentales. [59]

Véase también

Referencias

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Enlaces externos

Referencias de enlaces

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