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Uridina monofosfato sintasa

La enzima uridina monofosfato sintasa ( EC 4.1.1.23, UMPS ) ( orotato fosforribosil transferasa y orotidina-5'-descarboxilasa ) cataliza la formación de uridina monofosfato (UMP), una molécula transportadora de energía en muchas vías biosintéticas importantes. [5] En los humanos, el gen que codifica esta enzima se encuentra en el brazo largo del cromosoma 3 (3q13). [6]

Estructura y función

Esta enzima bifuncional tiene dos dominios principales, una subunidad de la orotato fosforribosiltransferasa (OPRTasa, EC 2.4.2.10) y una subunidad de la orotidina-5'-fosfato descarboxilasa (ODCasa, EC 4.1.1.23). [7] Estos dos sitios catalizan los dos últimos pasos de la vía biosintética de novo de la uridina monofosfato (UMP). Después de la adición de ribosa-P al orotato por la OPRTasa para formar la orotidina-5'-monofosfato (OMP), la OMP es descarboxilada para formar uridina monofosfato por la ODCasa. En los microorganismos, estos dos dominios son proteínas separadas, pero, en los eucariotas multicelulares, los dos sitios catalíticos se expresan en una sola proteína, la uridina monofosfato sintasa. [8]

La UMPS existe en varias formas, dependiendo de las condiciones externas. In vitro, la UMPS monomérica, con un coeficiente de sedimentación S 20,w de 3,6 se convertirá en un dímero, S 20,w = 5,1 después de la adición de aniones como el fosfato. En presencia de OMP, el producto de la OPRTasa, el dímero cambia a una forma de sedimentación más rápida S 20,w 5,6. [9] [10] Estas formas conformacionales separadas muestran diferentes actividades enzimáticas, con el monómero de la sintasa UMP mostrando una baja actividad descarboxilasa, y solo el dímero S 5,6 exhibiendo una actividad descarboxilasa completa. [11]

Se cree que los dos sitios catalíticos separados se fusionaron en una sola proteína para estabilizar su forma monomérica. La unión covalente en UMPS estabiliza los dominios que contienen los respectivos centros catalíticos, mejorando su actividad en organismos multicelulares donde las concentraciones tienden a ser 1/10 de las contrapartes separadas en procariotas. Otros microorganismos con enzimas separadas deben retener concentraciones más altas para mantener sus enzimas en su forma dimérica más activa. [12]

Fusión

Los eventos de fusión entre OPRTasa y ODCasa, que han llevado a la formación de la enzima bifuncional UMPS, han ocurrido de forma distinta en diferentes ramas del árbol de la vida. Por un lado, aunque la OPRTasa se encuentra en el extremo N y la ODCasa en el extremo C en la mayoría de los eucariotas (por ejemplo, Metazoa, Amoebozoa, Plantae y Heterolobosea), también se ha demostrado que existe la fusión invertida, es decir, OPRTasa en el extremo C y ODCasa en el extremo N (por ejemplo, protistas parásitos, tripanosomátidos y estramenópilas). Además, otros grupos eucariotas, como los hongos, conservan ambas enzimas como proteínas separadas. [13]

Por importante que sea el orden de fusión, el origen evolutivo de cada dominio catalítico en UMPS también es un tema de estudio. Tanto la OPRTasa como la ODCasa han pasado por transferencia lateral de genes, lo que dio como resultado que los eucariotas tuvieran enzimas de origen bacteriano y eucariota. Por ejemplo, Metazoa, Amoebozoa, Plantae y Heterolobosea tienen ODCasa y OPRTasa eucariotas, mientras que Alveolata y stramenopiles las tienen bacterianas. También son posibles otros reordenamientos, ya que los hongos tienen OPRTasa bacteriana y ODCasa eucariota, mientras que los cinetoplastos tienen la combinación inversa. [13]

Fusionando tanto el orden de fusión como el origen evolutivo, los organismos terminan teniendo UMPS fusionados donde uno de sus dominios catalíticos proviene de bacterias y el otro de eucariotas. [13]

La fuerza impulsora de estos eventos de fusión parece ser la estabilidad térmica adquirida. Las actividades OPRTasa y ODCasa del Homo sapiens disminuyen en mayor medida cuando se calienta que la proteína fusionada. [14]

Para determinar la fuerza impulsora de la asociación de proteínas, se han realizado varios experimentos separando ambos dominios y cambiando el péptido conector que los mantiene unidos. En Plasmodium falciparum , el complejo OPRTasa-OMPDCasa aumenta la estabilidad cinética y térmica en comparación con las enzimas monofuncionales. [15] En H. sapiens , aunque los dominios separados y fusionados tienen una actividad similar, los primeros tienen una mayor sensibilidad a las condiciones que promueven la disociación del monómero. [12] Además, el péptido conector se puede eliminar sin inactivar la catálisis. [14] En Leishmania donovani, la OPRTasa separada no tiene actividad detectable posiblemente debido a una menor estabilidad térmica o la falta de su péptido conector. [16]

Regulación

OPRTasa en complejo con OM

La UMPS está sujeta a una regulación compleja por parte de la OMP, el producto de su OPRTasa y el sustrato de la ODCasa. [17] La ​​OMP es un activador alostérico de la actividad de la OMP descarboxilasa. [10] A bajas concentraciones de enzima y bajas concentraciones de OMP, la OMP descarboxilasa muestra una cooperatividad negativa, mientras que, a concentraciones más altas de OMP, la enzima muestra una cooperatividad positiva. Sin embargo, cuando las concentraciones de enzima son más altas, esta cinética compleja no se manifiesta. [17] La ​​actividad de la orotato PRTasa se activa con bajas concentraciones de OMP, [18] fosfato, [8] y ADP. [19]

Mecanismo

OPRTasa

La OPRTasa de P. falciparum sigue una vía aleatoria en la síntesis y degradación de OMP. Los análisis del estado de transición han utilizado efectos isotópicos y cálculos cuánticos para revelar una estructura de orotato dianiónico completamente disociada, un ribocatión y una molécula de pirofosfato nucleofílica. No obstante, esto es inesperado, ya que la mayoría de las N-ribosiltransferasas involucran grupos salientes protonados y neutros, mientras que el orotato desprotonado no es bueno en el estado de transición catiónico. [20]

La OPRTasa, como miembro de las PRTasas de tipo I, tiene un bucle prominente junto a su sitio activo. Es flexible en su estado abierto y difícilmente se puede ver en los mapas de densidad electrónica de algunas OPRTasas. Para que se produzca la catálisis, debe existir un dímero en el que un bucle de una subunidad cubra el sitio activo de la otra. En Salmonella typhimurium , se crea un nuevo par de láminas β antiparalelas y se forman cinco nuevos contactos interatómicos en el bucle, entre el bucle y el resto de la proteína y entre el bucle y los ligandos. [21]

Existen dos posibilidades en cuanto al movimiento del bucle: podría moverse de manera rígida o podría provenir de una estructura desordenada que adquiere orden. El segundo escenario parece más probable que ocurra en la OPRTasa. Debe haber un equilibrio energético entre el nuevo orden del péptido y la formación de enlaces de hidrógeno en el bucle, entre el bucle y el resto de la proteína, y entre el bucle y los ligandos. Existe un equilibrio 30:1 entre las estructuras cerradas y abiertas en el complejo enzima-Mg-PRPP, lo que sugiere que la conformación cerrada es la favorecida. [21]

Se han propuesto varias funciones para los residuos del bucle catalítico. En primer lugar, parece haber una correlación entre el movimiento del bucle y la posición del sustrato de catálisis. En la reacción biológica, una transferencia de protones a la molécula de pirofosfato (PPi) podría minimizar la acumulación de carga negativa a pesar de que el pKa para PPi es 9. Lys26, His105 y Lys103 son candidatos para esta transferencia a la posición α del fosfato. Sin embargo, podría no ser el caso, ya que las cadenas laterales y el ion metálico podrían neutralizar parte de la carga negativa del PPi producido. La estabilización geométrica del estado de transición también podría obtenerse a través de la participación en el bucle. [21]

ODCase

Callahan y Miller (2007) resumen los mecanismos de la ODCasa en tres propuestas. La primera es la activación del carboxilo del sustrato a través de estrés electrostático. La unión del grupo fosforilo implica la yuxtaposición entre el grupo carboxilato y un residuo Asp cargado negativamente (a saber, Asp91 en Saccharomyces cerevisiae ). La repulsión entre las cargas negativas elevaría el valor de la energía cerca del estado de transición. No obstante, los análisis cristalográficos y la falta de afinidad de la enzima S. cerevisiae por los análogos del sustrato donde los grupos carboxilato se reemplazan por un sustituyente catiónico han mostrado cierta evidencia en contra de esta teoría. [22]

También se ha considerado la protonación de OMP en O4 u O2 antes de la descarboxilación, que conlleva la formación de iluro en N1. La ausencia de donador de protones cerca de O4 u O2 en las estructuras cristalográficas es una evidencia en contra de ella junto con la exclusión de la generación de iluro como un paso limitante en los experimentos con 15N. Además, han surgido dudas en cuanto a la viabilidad de los intermediarios protonados debido a la ausencia de estabilizadores electrónicos. Como consecuencia, se ha propuesto la ruptura del enlace entre C6 y C7 debido a la protonación del primero al pasar por un estado carbaniónico. [22]

Finalmente, la catálisis podría tener lugar por simple atracción electrostática. La formación del carbanión C6 crearía interacciones dipolares con una lisina catiónica del sitio activo. Esto no explica el aumento de velocidad en comparación con el proceso no catalizado. [22]

Importancia clínica

Una deficiencia de UMP sintasa puede provocar un trastorno metabólico llamado aciduria orótica . [23]

La deficiencia de esta enzima es un rasgo hereditario autosómico recesivo en el ganado Holstein y causará la muerte antes del nacimiento. [24]

La deficiencia de la enzima se puede estudiar en el organismo modelo Caenorhabditis elegans . La cepa rad-6 tiene un codón de terminación prematuro que elimina el dominio de la orotidina 5'-descarboxilasa de la proteína; este dominio no se encuentra en ninguna otra proteína codificada por el genoma. La cepa tiene un fenotipo pleiotrópico que incluye viabilidad y fertilidad reducidas, crecimiento lento y sensibilidad a la radiación. [25]

Importancia farmacológica

Se ha demostrado que UMPS y sus dos dominios separados, ODCase y OPRTase, son esenciales para la viabilidad de parásitos del taxón Chromoalveolata como L. donovani o P. falciparum . [16] [26] Dado que UMPS, ODCase y OPRTase son diferentes entre organismos, se han realizado investigaciones sobre inhibidores específicos de especies. [20] [26]

Inhibición

OPRTasa

Los estudios sobre la inhibición de la OPRTasa se basan en análogos de sustrato. En Mycobacterium tuberculosis , dos de los inhibidores más prometedores son el ácido 2,6-dihidroxipiridina-4-carboxílico y el ácido 3-bencilideno-2,6-dioxo-1,2,3,6-tetrahidropiridina-4-carboxílico. La entalpía de unión y la entropía de este último corresponden a ligandos de alta afinidad. Se están estudiando propiedades como la lipofilicidad, la solubilidad, la permeabilidad y las constantes de equilibrio. [27]

También se han utilizado productos de selenilación. Abdo et al. (2010) realizaron reacciones sobre el ácido 2-etoxietanselénico utilizando sustratos aromáticos ricos en electrones para producir (2-etoxietil)seleno éteres. Estos son capaces de convertirse en productos aril-selenilados como la familia 5-uridinil, que ha mostrado inhibición en concentraciones submicromolares en P. falciparum y H. sapiens . [28]

ODCase

Los inhibidores de la ODCasa también provienen de análogos de sustrato, como modificaciones en los anillos de OMP o UMP. En H. sapiens , la ODCasa ha sido inhibida por compuestos de haluro derivados de UMP (por ejemplo, 5-FUMP, 5-BrUMP, 5-IUMP y 6-IUMP). [29]

En Methanobacterium thermoautotrophicum , se ha aplicado una estrategia diferente, modificando ligandos interactuantes débiles como citidina-5'-monofosfato, que deriva en ribonucleósido-5'-monofosfato barbitúrico, xantosina-5'-monofosfato. [30] La ODCasa de P. falciparum se ha inhibido con éxito mediante modificaciones en citidina-5'-monofosfato N3 y N4. [31]

Mapa interactivo de rutas

Haga clic en los genes, proteínas y metabolitos que aparecen a continuación para acceder a los artículos correspondientes. [§ 1]

  1. ^ El mapa de la ruta interactiva se puede editar en WikiPathways: "FluoropyrimidineActivity_WP1601".

Véase también

Referencias

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Lectura adicional