Los snRNA espliceosomales U2 son una especie de moléculas de ARN nuclear pequeño ( snRNA ) que se encuentran en la maquinaria espliceosomales principales (Sm) de prácticamente todos los organismos eucariotas. In vivo , el snRNA U2 junto con sus polipéptidos asociados se ensamblan para producir la ribonucleoproteína nuclear pequeña U2 ( snRNP ), un componente esencial del complejo espliceosomales principales. [1] La vía principal de empalme espliceosomales se denomina ocasionalmente dependiente de U2, con base en una clase de intrón Sm (que se encuentra en las transcripciones primarias de ARNm) que son reconocidas exclusivamente por el snRNP U2 durante las primeras etapas del ensamblaje espliceosomales. [2] Además del reconocimiento de intrones dependiente de U2, se ha teorizado que el snRNA U2 también cumple una función catalítica en la química del empalme del pre-ARN. [3] [4] De manera similar a los ARN ribosómicos ( ARNr ), los ARNnsm deben mediar tanto los contactos ARN:ARN como ARN:proteína y, por lo tanto, han desarrollado elementos estructurales primarios y secundarios especializados y altamente conservados para facilitar este tipo de interacciones. [5] [6]
Poco después del descubrimiento de que las transcripciones primarias de ARNm contienen secuencias intermedias largas y no codificantes ( intrones ) por Sharp y Roberts , [7] [8] Joan Steitz comenzó a trabajar para caracterizar el mecanismo bioquímico de la escisión de intrones. [9] La curiosa observación de que una secuencia encontrada en la región 5' del ARNpn U1 exhibió una extensa complementariedad de apareamiento de bases con secuencias conservadas a lo largo de las uniones de empalme 5' en las transcripciones de ARNhn impulsó la especulación de que ciertos ARNpn pueden estar involucrados en el reconocimiento de los límites del sitio de empalme a través de contactos ARN:ARN. [9] Solo recientemente las estructuras cristalinas atómicas han revelado de manera demostrable que la conjetura original era de hecho correcta, incluso si la complejidad de estas interacciones no se comprendió completamente en ese momento. [5] [6] [10]
En Saccharomyces cerevisiae, el ARNpn U2 está asociado con 18 polipéptidos , siete de los cuales son proteínas estructurales comunes a todos los ARNpn de clase Sm. [11] Estas proteínas estructurales no específicas se asocian con los ARNpn Sm a través de una secuencia de reconocimiento altamente conservada (AU n G, n = 4-6) ubicada dentro del ARN llamada sitios de unión a Sm. [12] Otras dos proteínas, A´ y B´´, son específicas de U2 y requieren elementos estructurales exclusivos del ARNpn U2 (específicamente dos bucles de tallo 3´) para el ensamblaje del ARNpn. [11] Los complejos proteicos SF3a de tres subunidades y SF3b de seis subunidades también se asocian con el ARNpn U2. [13]
El ARNm U2 sn está implicado en el reconocimiento de intrones a través de una secuencia de 7-12 nucleótidos entre 18-40 nucleótidos aguas arriba del sitio de empalme 3' conocido como secuencia de punto de ramificación (BPS). [1] [2] En la levadura , el BPS de consenso tiene 7 residuos de nucleótidos de longitud y la secuencia de reconocimiento complementaria dentro del ARNm U2 sn tiene 6 nucleótidos. La formación de dúplex entre estas dos secuencias da como resultado el abultamiento de un residuo de adenosina conservado en la posición 5 del BPS. El residuo de adenosina abultado adopta una conformación C3'-endo [14] que con la ayuda de los factores de empalme Cwc25, Yju2 e Isy1 alinea un OH 2' para un ataque en línea de un átomo de fósforo en el sitio de empalme 5'. [15] El ataque nucleofílico inicia la primera de dos reacciones de transesterificación sucesivas que eliminan el intrón (a través de un intermediario de lazo inusual unido 2'-5'-3'), donde la segunda transesterificación implica la ligadura de los dos exones flanqueantes.
Aunque la longitud de la secuencia de los snRNA U2 puede variar hasta en un orden de magnitud en todos los organismos eucariotas , todos los snRNA U2 contienen muchas regiones filogenéticamente constantes, particularmente dentro de los primeros 80 nucleótidos aguas abajo del extremo 5' donde el 85% de las posiciones están conservadas. [16] Además, varios elementos estructurales secundarios también están conservados, incluidos los bucles de tallo I, II, III, IV y algunas de las regiones monocatenarias que unen estos dominios. [16] [17] El bucle de tallo II en el snRNA U2 de levadura, contiene un par de bases GA cizalladas inusuales que conducen a un motivo de bucle de giro en U característico que comparte una conformación geométrica similar a la de los bucles anticodón del ARNt . [5] Todos los snRNA U2 poseen un bucle de tallo terminal (IV) con una hélice de 10-16 pares de bases y un bucle conservado de 11 nucleótidos con la secuencia de consenso 5'-UYGCANUURYN-3'. [16]
Los ARNpn U2 son los ARNp nucleares pequeños más ampliamente modificados. [18] Si bien las ubicaciones exactas de estas modificaciones postranscripcionales pueden variar de un organismo a otro, la evidencia emergente sugiere que existe una fuerte correlación entre la modificación del ARNpn U2 y la función biológica. [18] Las modificaciones incluyen la conversión de algunos residuos de uridina a pseudouridina , 2'-O-metilación, metilación de nucleobases y conversión de la tapa de guanosina 5'-monometilada a una tapa de guanosina 2,2,7-trimetilada. [18] Muchas de estas modificaciones residen en una región de 27 nucleótidos en el extremo 5' de la molécula. [18]
El espliceosoma es una máquina molecular dinámica que sufre varios reordenamientos conformacionales durante el ensamblaje y el empalme. Aunque muchos de los detalles bioquímicos que rodean los reordenamientos espliceosomales siguen sin estar claros, estudios recientes han visualizado la formación de un complejo de plegamiento crítico entre los ARNpn U2 y U6 inmediatamente antes del primer paso de la reacción de empalme. [19] [6] Este evento de plegamiento facilita la formación de una unión de cuatro hélices, que se cree que proporciona un andamiaje para los componentes críticos del sitio activo, incluida la alineación del sitio de empalme 5' con el punto de ramificación adenosina para el ataque en línea por el 2' OH y la coordinación de dos iones Mg 2+ para estabilizar la formación de carga negativa en los pasos siguientes. [19]
Una característica notable del pliegue U2-U6 es su similitud estructural con la del dominio V en los intrones del grupo II autoempalmables . [6] [3] La tríada AGC encontrada en el ARNpn U6 se conserva en los intrones del grupo II y se ha descubierto que también favorece las mismas interacciones de apilamiento terciario. [6] La formación de un par de bamboleo GU temprano en el evento de plegamiento U2-U6 también se observa en la formación del núcleo catalítico de los intrones del grupo II. [19] Finalmente, es probable que el espliceosoma utilice el mismo mecanismo de dos iones metálicos que los intrones del grupo II dada la conservación estructural de los sitios de unión de metales encontrados dentro del pliegue U2-U6. [3] El grado de conservación de la estructura secundaria y terciaria entre los intrones del grupo II y el pliegue U2-U6 en el sitio activo del espliceosoma sugiere fuertemente que tanto los intrones del grupo II como el espliceosoma comparten un origen evolutivo común.