Trayectoria de una sola partícula

Las trayectorias de partículas individuales ( SPT , por sus siglas en inglés) consisten en una colección de puntos discretos sucesivos que se suceden en el tiempo. Estas trayectorias se obtienen a partir de imágenes de datos experimentales. En el contexto de la biología celular, las trayectorias se obtienen mediante la activación transitoria mediante un láser de pequeños colorantes adheridos a una molécula en movimiento.

Las moléculas ahora se pueden visualizar basándose en la reciente microscopía de súper resolución , que permite recopilaciones rutinarias de miles de trayectorias cortas y largas. ^[1] Estas trayectorias exploran parte de una célula, ya sea en la membrana o en 3 dimensiones y sus caminos están influenciados críticamente por la organización local abarrotada y la interacción molecular dentro de la célula, ^[2] como se enfatiza en varios tipos de células como las células neuronales, ^[3] astrocitos , células inmunes y muchas otras.

Los SPT permiten observar moléculas en movimiento dentro de las células para recopilar estadísticas

La SPT ha permitido observar partículas en movimiento. Estas trayectorias se utilizan para investigar la organización del citoplasma o de la membrana ^[4] , pero también la dinámica del núcleo celular, la dinámica de los remodeladores o la producción de ARNm. Debido a la mejora constante de la instrumentación, la resolución espacial disminuye continuamente, alcanzando ahora valores de aproximadamente 20 nm, mientras que el paso de tiempo de adquisición suele estar en el rango de 10 a 50 ms para capturar eventos cortos que ocurren en tejidos vivos. Una variante de la microscopía de superresolución llamada sptPALM se utiliza para detectar la organización local y dinámicamente cambiante de las moléculas en las células, o eventos de unión del ADN por factores de transcripción en el núcleo de los mamíferos. La adquisición de imágenes de superresolución y el seguimiento de partículas son cruciales para garantizar datos de alta calidad ^{[5] [6] [7]}

Recopilación de puntos en una trayectoria basada en algoritmos de seguimiento

Una vez adquiridos los puntos, el siguiente paso es reconstruir una trayectoria. Este paso se realiza mediante algoritmos de seguimiento conocidos para conectar los puntos adquiridos. ^[8] Los algoritmos de seguimiento se basan en un modelo físico de trayectorias perturbadas por un ruido aleatorio aditivo.

Extraer parámetros físicos de SPT redundantes

La redundancia de muchas trayectorias cortas (SPT) es una característica clave para extraer parámetros de información biofísica de datos empíricos a nivel molecular. ^[9] En contraste, se han utilizado trayectorias largas y aisladas para extraer información a lo largo de trayectorias, destruyendo la heterogeneidad espacial natural asociada a las diversas posiciones. La principal herramienta estadística es calcular el desplazamiento cuadrático medio (MSD) o momento estadístico de segundo orden :

${\displaystyle \langle |X(t+\Delta t)-X(t)|^{2}\rangle \sim t^{\alpha }}$^{[10] [11]} (promedio sobre realizaciones ), donde se denomina exponente anómalo. ${\displaystyle \alpha }$

Para un movimiento browniano, , donde D es el coeficiente de difusión, n es la dimensión del espacio. También se pueden recuperar algunas otras propiedades de trayectorias largas, como el radio de confinamiento para un movimiento confinado. ^[12] El MSD se ha utilizado ampliamente en aplicaciones tempranas de trayectorias largas pero no necesariamente redundantes de una sola partícula en un contexto biológico. Sin embargo, el MSD aplicado a trayectorias largas sufre de varios problemas. Primero, no es preciso en parte porque los puntos medidos podrían estar correlacionados. Segundo, no se puede utilizar para calcular ningún coeficiente de difusión física cuando las trayectorias consisten en episodios cambiantes, por ejemplo, alternando entre difusión libre y confinada. A baja resolución espaciotemporal de las trayectorias observadas, el MSD se comporta de manera sublineal con el tiempo, un proceso conocido como difusión anómala, que se debe en parte al promedio de las diferentes fases del movimiento de la partícula. En el contexto del transporte celular (ameboide), el análisis de movimiento de alta resolución de SPT largos ^[13] en cámaras microfluídicas que contienen obstáculos reveló diferentes tipos de movimientos celulares. Dependiendo de la densidad de obstáculos: se encontró arrastre con baja densidad de obstáculos e incluso se pueden diferenciar movimientos dirigidos y fases aleatorias. ${\displaystyle \langle |X(t+\Delta t)-X(t)|^{2}\rangle =2nDt}$

Modelo físico para recuperar propiedades espaciales de SPT redundantes

Las ecuaciones de Langevin y Smoluchowski como modelo de movimiento

Los métodos estadísticos para extraer información de los SPT se basan en modelos estocásticos, como la ecuación de Langevin o su límite de Smoluchowski y modelos asociados que tienen en cuenta el ruido de identificación de puntos de localización adicional o el núcleo de memoria. ^[14] La ecuación de Langevin describe una partícula estocástica impulsada por una fuerza browniana y un campo de fuerza (por ejemplo, electrostática, mecánica, etc.) con una expresión : ${\displaystyle \Xi }$ ${\displaystyle F(x,t)}$

${\displaystyle m{\ddot {x}}+\Gamma {\dot {x}}-F(x,t)=\Xi ,}$

donde m es la masa de la partícula y es el coeficiente de fricción de una partícula que se difunde, la viscosidad . Aquí está el ruido blanco gaussiano correlacionado . La fuerza se puede derivar de un pozo de potencial U de modo que y en ese caso, la ecuación toma la forma ${\displaystyle \Gamma =6\pi a\rho }$ ${\displaystyle \rho }$ ${\displaystyle \Xi }$ ${\displaystyle \delta }$ ${\displaystyle F(x,t)=-U'(x)}$

${\displaystyle m{\frac {d^{2}x}{dt^{2}}}+\Gamma {\frac {dx}{dt}}+\nabla U(x)={\sqrt {2\varepsilon \gamma }}\,{\frac {d\eta }{dt}},}$

donde es la energía y la constante de Boltzmann y T la temperatura. La ecuación de Langevin se utiliza para describir trayectorias en las que la inercia o la aceleración son importantes. Por ejemplo, en escalas de tiempo muy cortas, cuando una molécula se desvincula de un sitio de unión o escapa de un pozo de potencial ^[15] y el término de inercia permite que las partículas se alejen del atractor y, por lo tanto, evita la reunificación inmediata que podría afectar las simulaciones numéricas. ${\displaystyle \varepsilon =k_{\text{B}}T,}$ ${\displaystyle k_{\text{B}}}$

En el gran límite de fricción las trayectorias de la ecuación de Langevin convergen en probabilidad a las de la ecuación de Smoluchowski. ${\displaystyle \gamma \to \infty }$ ${\displaystyle x(t)}$

${\displaystyle \gamma {\dot {x}}+U^{\prime }(x)={\sqrt {2\varepsilon \gamma }}\,{\dot {w}},}$

donde está correlacionada. Esta ecuación se obtiene cuando el coeficiente de difusión es constante en el espacio. Cuando no es así, se deben derivar ecuaciones de grano grueso (con una resolución espacial gruesa) a partir de consideraciones moleculares. La interpretación de las fuerzas físicas no se resuelve mediante representaciones integrales de Ito vs. Stratonovich ni ninguna otra. ${\displaystyle {\dot {w}}(t)}$ ${\displaystyle \delta }$

Ecuaciones generales del modelo

Para una escala de tiempo mucho más larga que la colisión molecular elemental, la posición de una partícula rastreada se describe mediante un límite sobreamortiguado más general del modelo estocástico de Langevin. De hecho, si la escala de tiempo de adquisición de las trayectorias registradas empíricamente es mucho menor en comparación con las fluctuaciones térmicas, los eventos rápidos no se resuelven en los datos. Por lo tanto, en esta escala espaciotemporal más burda, la descripción del movimiento se reemplaza por una ecuación estocástica efectiva.

${\displaystyle {\dot {X}}(t)={b}(X(t))+{\sqrt {2}}{B}_{e}(X(t)){\dot {w}}(t),\qquad \qquad (1)}$

donde es el campo de deriva y la matriz de difusión. El tensor de difusión efectivo puede variar en el espacio ( denota la transpuesta de ). Esta ecuación no se deriva sino que se supone. Sin embargo, el coeficiente de difusión debería ser lo suficientemente suave ya que cualquier discontinuidad en D debería resolverse mediante un escalamiento espacial para analizar la fuente de discontinuidad (generalmente obstáculos inertes o transiciones entre dos medios). El tensor de difusión efectivo observado no es necesariamente isotrópico y puede depender del estado, mientras que el coeficiente de fricción permanece constante mientras el medio permanezca igual y el coeficiente de difusión microscópico (o tensor) podría permanecer isotrópico. ${\displaystyle {b}(X)}$ ${\displaystyle {B}_{e}}$ ${\displaystyle D(X)={\frac {1}{2}}B(X)B^{T}X^{T}}$ ${\textstyle X^{T}}$ ${\textstyle X}$ ${\displaystyle \gamma }$

Análisis estadístico de estas trayectorias

El desarrollo de métodos estadísticos se basa en modelos estocásticos, un posible procedimiento de deconvolución aplicado a las trayectorias. Las simulaciones numéricas también podrían utilizarse para identificar características específicas que podrían extraerse de los datos de trayectorias de partículas individuales. ^[16] El objetivo de construir un conjunto estadístico a partir de datos de SPT es observar las propiedades físicas locales de las partículas, como la velocidad, la difusión, el confinamiento o las fuerzas de atracción que reflejan las interacciones de las partículas con sus entornos nanométricos locales. Es posible utilizar el modelado estocástico para construir a partir del coeficiente de difusión (o tensor) el confinamiento o la densidad local de obstáculos que reflejan la presencia de objetos biológicos de diferentes tamaños.

Estimadores empíricos para el tensor de deriva y difusión de unproceso estocástico

Se han propuesto varios estimadores empíricos para recuperar el coeficiente de difusión local, el campo vectorial e incluso patrones organizados en la deriva, como pozos de potencial. ^[17] La ​​construcción de estimadores empíricos que sirven para recuperar propiedades físicas a partir de estadísticas paramétricas y no paramétricas. La recuperación de parámetros estadísticos de un proceso de difusión a partir de estadísticas de series de tiempo unidimensionales utiliza el estimador de primer momento o inferencia bayesiana.

Los modelos y el análisis suponen que los procesos son estacionarios, de modo que las propiedades estadísticas de las trayectorias no cambian con el tiempo. En la práctica, esta suposición se cumple cuando las trayectorias se adquieren durante menos de un minuto, cuando solo pueden producirse unos pocos cambios lentos en la superficie de una neurona, por ejemplo. El comportamiento no estacionario se observa mediante un análisis de lapso de tiempo, con un retraso de decenas de minutos entre adquisiciones sucesivas.

El modelo de grano grueso Eq. 1 se recupera a partir de los momentos condicionales de la trayectoria calculando los incrementos : ${\displaystyle \Delta X=X(t+\Delta t)-X(t)}$

${\displaystyle a(x)=\lim _{\Delta t\rightarrow 0}{\frac {E[\Delta X(t)\mid X(t)=x]}{\Delta t}},}$

${\displaystyle D(x)=\lim _{\Delta t\rightarrow 0}{\frac {E[\Delta X(t)^{T}\,\Delta X(t)\mid X(t)=x]}{2\,\Delta t}}.}$

Aquí la notación significa promediar todas las trayectorias que están en el punto x en el tiempo  t . Los coeficientes de la ecuación de Smoluchowski se pueden estimar estadísticamente en cada punto x a partir de una muestra infinitamente grande de sus trayectorias en la vecindad del punto x en el tiempo  t . ${\displaystyle E[\cdot \,|\,X(t)=x]}$

Estimación empírica

En la práctica, las expectativas para a y D se estiman mediante promedios de muestras finitas y es la resolución temporal de las trayectorias registradas. Las fórmulas para a y D se aproximan en el paso de tiempo , donde para decenas a cientos de puntos que caen en cualquier intervalo. Esto suele ser suficiente para la estimación. ${\displaystyle \Delta t}$ ${\displaystyle \Delta t}$

Para estimar los coeficientes de deriva y difusión locales, primero se agrupan las trayectorias dentro de un pequeño vecindario. El campo de observación se divide en compartimentos cuadrados de lado r y centro y se estiman la deriva y difusión locales para cada uno de los cuadrados. Considerando una muestra con trayectorias donde son los tiempos de muestreo, la discretización de la ecuación para la deriva en la posición se da para cada proyección espacial en los ejes x e y mediante ${\displaystyle S(x_{k},r)}$ ${\displaystyle x_{k}}$ ${\displaystyle N_{t}}$ ${\displaystyle \{x^{i}(t_{1}),\dots ,x^{i}(t_{N_{s}})\},}$ ${\displaystyle t_{j}}$ ${\displaystyle a(x_{k})=(a_{x}(x_{k}),a_{y}(x_{k}))}$ ${\displaystyle x_{k}}$

${\displaystyle a_{x}(x_{k})\approx {\frac {1}{N_{k}}}\sum _{j=1}^{N_{t}}\sum _{i=0,{\tilde {x}}_{i}^{j}\in S(x_{k},r)}^{N_{s}-1}\left({\frac {x_{i+1}^{j}-x_{i}^{j}}{\Delta t}}\right)}$

${\displaystyle a_{y}(x_{k})\approx {\frac {1}{N_{k}}}\sum _{j=1}^{N_{t}}\sum _{i=0,{\tilde {x}}_{i}^{j}\in S(x_{k},r)}^{N_{s}-1}\left({\frac {y_{i+1}^{j}-y_{i}^{j}}{\Delta t}}\right),}$

donde es el número de puntos de la trayectoria que caen en el cuadrado . De manera similar, los componentes del tensor de difusión efectivo se aproximan mediante las sumas empíricas ${\displaystyle N_{k}}$ ${\displaystyle S(x_{k},r)}$ ${\displaystyle D(x_{k})}$

${\displaystyle D_{xx}(x_{k})\approx {\frac {1}{N_{k}}}\sum _{j=1}^{N_{t}}\sum _{i=0,x_{i}\in S(x_{k},r)}^{N_{s}-1}{\frac {(x_{i+1}^{j}-x_{i}^{j})^{2}}{2\,\Delta t}},}$

${\displaystyle D_{yy}(x_{k})\approx {\frac {1}{N_{k}}}\sum _{j=1}^{N_{t}}\sum _{i=0,x_{i}\in S(x_{k},r)}^{N_{s}-1}{\frac {(y_{i+1}^{j}-y_{i}^{j})^{2}}{2\,\Delta t}},}$

${\displaystyle D_{xy}(x_{k})\approx {\frac {1}{N_{k}}}\sum _{j=1}^{N_{t}}\sum _{i=0,x_{i}\in S(x_{k},r)}^{N_{s}-1}{\frac {(x_{i+1}^{j}-x_{i}^{j})(y_{i+1}^{j}-y_{i}^{j})}{2\,\Delta t}}.}$

La estimación del momento requiere un gran número de trayectorias que pasen por cada punto, lo que concuerda precisamente con los datos masivos generados por ciertos tipos de datos de súper resolución, como los adquiridos con la técnica sptPALM en muestras biológicas. La inversión exacta de la ecuación de Lagenvin exige en teoría un número infinito de trayectorias que pasen por cualquier punto x de interés. En la práctica, la recuperación del tensor de deriva y difusión se obtiene después de subdividir una región mediante una cuadrícula cuadrada de radio r o mediante el movimiento de ventanas deslizantes (del orden de 50 a 100 nm).

Recuperación automatizada del límite de un nanodominio

Los algoritmos basados ​​en el mapeo de la densidad de puntos extraídos de trayectorias permiten revelar interacciones locales de enlace y tráfico y la organización de sitios subcelulares dinámicos. Los algoritmos se pueden aplicar para estudiar regiones de alta densidad, reveladas por SPT. Algunos ejemplos son los orgánulos como el retículo endoplasmático o las membranas celulares. El método se basa en la segmentación espaciotemporal para detectar la arquitectura local y los límites de las regiones de alta densidad para dominios que miden cientos de nanómetros. ^[18]

Referencias

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3. Giannone G, Hosy E, Levet F, Constals A, Schulze K, Sobolevsky AI, Rosconi MP, Gouaux E, Tampe R, Choquet D, Cognet L, 2010. Imágenes dinámicas de superresolución de proteínas endógenas en células vivas a densidad ultraalta. {Biophys. J.} {99}:1303–1310.
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8. Saxton MJ, 2008. Seguimiento de partículas individuales: conectando los puntos. Nat. Methods, 5:671–672.
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15. Holcman D, 2013. Descubriendo nuevas características ocultas en datos de microscopía de superresolución. Commun Integr Biol. 6} (3):e23893.
16. Hoze N, Holcman D, 2014. Tiempos de residencia de receptores en espinas dendríticas analizados mediante simulaciones estocásticas en dominios empíricos. Biophys. J. 107:3008–17.
17. Hoze, N.; Holcman, D. (30 de noviembre de 2017). "Métodos estadísticos para un gran conjunto de trayectorias estocásticas de partículas individuales de súper resolución". bioRxiv : 227090. doi :10.1101/227090. S2CID  89788749 . Consultado el 30 de enero de 2021 .
18. Parutto, Pierre; Heck, Jennifer; Lu, Meng; Kaminski, Clemens; Avezov, Edward; Heine, Martin; Holcman, David (22 de agosto de 2022). "El análisis de trayectoria de partículas individuales de superresolución y alto rendimiento reconstruye la dinámica de los orgánulos y la reorganización de la membrana". Cell Reports Methods . 2 (8): 100277. doi :10.1016/j.crmeth.2022.100277. ISSN  2667-2375. PMC 9421586 . PMID  36046627.