La transformación de cloruro de calcio ( CaCl 2 ) es una técnica de laboratorio en biología de células procarióticas (bacterianas) . [1] La adición de cloruro de calcio a una suspensión celular promueve la unión del ADN plasmídico a los lipopolisacáridos (LPS). Los iones de calcio cargados positivamente atraen tanto la columna vertebral del ADN con carga negativa como los grupos cargados negativamente en el núcleo interno del LPS. El ADN plasmídico puede luego pasar a la célula mediante un choque térmico , donde las células enfriadas (+4 grados Celsius) se calientan a una temperatura más alta (+42 grados Celsius) durante un corto tiempo.
Frederick Griffith publicó el primer informe sobre el potencial de transformación de las bacterias en 1928. [2] Griffith observó que los ratones no sucumbían al tipo "áspero" de neumococo ( Streptococcus pneumoniae ), conocido como no virulento, pero sí sucumbían al tipo "suave" cepa, que se conoce como virulenta. La virulencia de la cepa suave podría suprimirse mediante la eliminación del calor. Sin embargo, cuando la cepa rugosa no virulenta se combinó con la cepa suave muerta por calor, la cepa rugosa logró adquirir el fenotipo suave y así volverse virulenta. La investigación de Griffith indicó que el cambio fue provocado por una sustancia no viva y termoestable generada a partir de la cepa suave. Más tarde, Oswald Avery, Colin MacLeod y Maclyn McCarty identificaron esta sustancia transformacional como ADN en 1944. [3]
Dado que el ADN es una molécula muy hidrófila , a menudo no puede atravesar la membrana celular bacteriana. Por tanto, es necesario hacer que las bacterias sean competentes para poder internalizar el ADN . Esto se puede lograr suspendiendo bacterias en una solución con una alta concentración de calcio , lo que crea pequeños agujeros en las células de la bacteria [ cita requerida ] . La suspensión de calcio, junto con la incubación del ADN junto con células competentes en hielo, seguida de un breve choque térmico, provocará directamente que el ADN extracromosómico entre forzosamente en la célula. [4]
Según investigaciones anteriores, las moléculas del receptor de LPS en la superficie celular competente se unen a una molécula de ADN desnuda . [1] Esta unión se produce debido al hecho de que las moléculas de ADN cargadas negativamente y el LPS forman complejos de coordinación con los cationes divalentes. Debido a su tamaño, el ADN no puede atravesar por sí solo la membrana celular para llegar al citoplasma. La membrana celular de las células tratadas con CaCl 2 se despolariza severamente durante la etapa de choque térmico y, como resultado, la caída en el potencial de membrana reduce la naturaleza negativa del potencial interno de la célula, permitiendo que el ADN cargado negativamente fluya hacia el interior de la célula. . Posteriormente, mediante un posterior choque frío, el potencial de membrana puede volver a elevarse a su valor inicial. [4]
Las células competentes son células bacterianas con paredes celulares rediseñadas que facilitan el paso del ADN extraño. Sin tratamientos químicos o eléctricos particulares que las hagan capaces, la mayoría de los tipos de células no pueden absorber el ADN con éxito , por esa razón, el tratamiento con iones de calcio es el procedimiento típico para modificar las bacterias para que sean permeables al ADN. [5] En las bacterias, la competencia está estrechamente regulada y diferentes especies bacterianas tienen diferentes características relacionadas con la competencia. Aunque comparten algunas similitudes, las proteínas de competencia generadas por bacterias Gram positivas y Gram negativas son diferentes. [6]
La competencia natural se resume en tres métodos mediante los cuales las bacterias pueden adquirir ADN de su entorno: conjugación , transformación y transducción . [7] A medida que el ADN se inserta en la célula durante la transformación, las células receptoras deben encontrarse en cierta condición fisiológica conocida como estado competente para poder aceptar el ADN en transformación . [6] Una vez que el ADN ha entrado en el citoplasma de la célula, enzimas como la nucleasa pueden descomponerlo. En los casos en los que el ADN es extremadamente similar al material genético de la propia célula, las enzimas reparadoras del ADN lo recombinan con el cromosoma. [8]
Evidentemente, los genes de una célula no incluyen ninguna información sobre competencia artificial. Este tipo de competencia requiere un proceso de laboratorio que cree condiciones que no suelen existir en la naturaleza para que las células puedan volverse permeables al ADN . [9] Aunque la eficiencia de la transformación es a menudo pobre, este proceso es relativamente simple y rápido de aplicar en la ingeniería genética bacteriana. Mandel e Higa, [10] quienes crearon un procedimiento sencillo basado en remojar las células en CaCl 2 frío , proporcionaron la base para obtener células sintéticas competentes. La transformación química, como la transformación con cloruro de calcio y la electroporación , son los métodos más utilizados para transformar células bacterianas, como las células de E. coli , con ADN plasmídico . [5]
El tratamiento con cloruro de calcio se utiliza generalmente para la transformación de E. coli y otras bacterias. [11] Mejora la incorporación del ADN plasmídico por parte de la célula bacteriana, promoviendo la transformación genética . El ADN plasmídico puede unirse al LPS agregándolo a la solución celular junto con CaCl 2 . [12] Por lo tanto, cuando se aplica un choque térmico, la columna vertebral del ADN cargada negativamente y el LPS se combinan, permitiendo que el ADN plasmídico ingrese a la célula bacteriana. [13]
El proceso se resume en los siguientes pasos según el protocolo de The Under Graduate Journal of Experimental Microbiology and Immunology (UJEMI) :