Las sondas TaqMan son sondas de hidrólisis diseñadas para aumentar la especificidad de la PCR cuantitativa . El método fue informado por primera vez en 1991 por el investigador Kary Mullis de Cetus Corporation, [1] y la tecnología fue desarrollada posteriormente por Hoffmann-La Roche para ensayos de diagnóstico y por Applied Biosystems (ahora parte de Thermo Fisher Scientific ) para aplicaciones de investigación.
El principio de la sonda TaqMan se basa en la actividad exonucleasa 5´–3´ de la polimerasa Taq para escindir una sonda con doble etiqueta durante la hibridación con la secuencia objetivo complementaria y la detección basada en fluoróforos . [2] Como en otros métodos de PCR cuantitativa , la señal de fluorescencia resultante permite mediciones cuantitativas de la acumulación del producto durante las etapas exponenciales de la PCR; sin embargo, la sonda TaqMan aumenta significativamente la especificidad de la detección. Las sondas TaqMan recibieron el nombre del videojuego Pac-Man ( Taq Polymerase + PacMan = TaqMan) ya que su mecanismo se basa en el principio Pac-Man. [3]
Las sondas TaqMan constan de un fluoróforo unido covalentemente al extremo 5' de la sonda oligonucleotídica y un desactivador en el extremo 3'. [4] Se encuentran disponibles varios fluoróforos diferentes (por ejemplo, 6-carboxifluoresceína , acrónimo: FAM , o tetraclorofluoresceína, acrónimo: TET) y extintores (por ejemplo, tetrametilrodamina , acrónimo: TAMRA). [5] La molécula extintor apaga la fluorescencia emitida por el fluoróforo cuando es excitado por la fuente de luz del ciclador a través de la transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET). [6] Mientras el fluoróforo y el extintor estén cerca, el extintor inhibe cualquier señal de fluorescencia.
Las sondas TaqMan están diseñadas de manera que se hibridan dentro de una región de ADN amplificada por un conjunto específico de cebadores. (A diferencia del diagrama, la sonda se une a ADN monocatenario). Las sondas TaqMan se pueden conjugar con un resto ligante de surcos menores (MGB), tripéptido dihidrociclopirroloindol (DPI 3 ), para aumentar su afinidad de unión a la secuencia objetivo; Las sondas conjugadas con MGB tienen una temperatura de fusión más alta (Tm ) debido a una mayor estabilización de las fuerzas de van der Waals. A medida que la Taq polimerasa extiende el cebador y sintetiza la cadena naciente (a partir de la plantilla monocatenaria), la actividad exonucleasa 5' a 3' de la Taq polimerasa degrada la sonda que se ha hibridado con la plantilla. La degradación de la sonda libera el fluoróforo y rompe la proximidad al extintor, aliviando así el efecto de extinción y permitiendo la fluorescencia del fluoróforo. Por lo tanto, la fluorescencia detectada en el ciclador térmico de PCR cuantitativa es directamente proporcional al fluoróforo liberado y la cantidad de plantilla de ADN presente en la PCR.
Los ensayos basados en sondas TaqMan se utilizan ampliamente en PCR cuantitativa en laboratorios médicos y de investigación :
1. Recursos de TaqMan RT-PCR: bases de datos de cebadores, software y protocolos Archivado el 25 de noviembre de 2010 en Wayback Machine
2. Beacon Designer: software para diseñar cebadores y sondas de PCR en tiempo real, incluidos cebadores SYBR Green, sondas TaqMan y balizas moleculares.