Las sondas TaqMan son sondas de hidrólisis diseñadas para aumentar la especificidad de la PCR cuantitativa . El método fue descrito por primera vez en 1991 por el investigador Kary Mullis de Cetus Corporation [1] y la tecnología fue desarrollada posteriormente por Hoffmann-La Roche para ensayos de diagnóstico y por Applied Biosystems (ahora parte de Thermo Fisher Scientific ) para aplicaciones de investigación.
El principio de la sonda TaqMan se basa en la actividad exonucleasa 5'–3' de la polimerasa Taq para escindir una sonda de doble marcado durante la hibridación con la secuencia diana complementaria y la detección basada en fluoróforos . [2] Al igual que en otros métodos de PCR cuantitativa , la señal de fluorescencia resultante permite mediciones cuantitativas de la acumulación del producto durante las etapas exponenciales de la PCR; sin embargo, la sonda TaqMan aumenta significativamente la especificidad de la detección. Las sondas TaqMan recibieron su nombre del videojuego Pac-Man ( Taq Polymerase + PacMan = TaqMan) ya que su mecanismo se basa en el principio de Pac-Man. [3]
Las sondas TaqMan consisten en un fluoróforo unido covalentemente al extremo 5' de la sonda de oligonucleótidos y un extintor en el extremo 3'. [4] Hay disponibles varios fluoróforos diferentes (por ejemplo, 6-carboxifluoresceína , acrónimo: FAM , o tetraclorofluoresceína, acrónimo: TET) y extintores (por ejemplo, tetrametil rodamina , acrónimo: TAMRA). [5] La molécula extintora extingue la fluorescencia emitida por el fluoróforo cuando es excitado por la fuente de luz del ciclador a través de la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET). [6] Mientras el fluoróforo y el extintor estén cerca, la extinción inhibe cualquier señal de fluorescencia.
Las sondas TaqMan están diseñadas de tal manera que se anillan dentro de una región de ADN amplificada por un conjunto específico de cebadores. (A diferencia del diagrama, la sonda se une al ADN monocatenario). Las sondas TaqMan se pueden conjugar con una fracción de unión al surco menor (MGB), el tripéptido dihidrociclopirroloindol (DPI 3 ), para aumentar su afinidad de unión a la secuencia diana; las sondas conjugadas con MGB tienen una temperatura de fusión (T m ) más alta debido a una mayor estabilización de las fuerzas de van der Waals. A medida que la polimerasa Taq extiende el cebador y sintetiza la hebra naciente (a partir de la plantilla monocatenaria), la actividad exonucleasa 5' a 3' de la polimerasa Taq degrada la sonda que se ha anillado a la plantilla. La degradación de la sonda libera el fluoróforo y rompe la proximidad con el extintor, aliviando así el efecto extintor y permitiendo la fluorescencia del fluoróforo. Por lo tanto, la fluorescencia detectada en el termociclador de PCR cuantitativa es directamente proporcional al fluoróforo liberado y a la cantidad de plantilla de ADN presente en la PCR.
Los ensayos basados en sonda TaqMan se utilizan ampliamente en PCR cuantitativa en laboratorios médicos y de investigación :
1. Recursos de RT-PCR TaqMan: bases de datos de cebadores, software, protocolos Archivado el 25 de noviembre de 2010 en Wayback Machine.
2. Beacon Designer: software para diseñar cebadores y sondas de PCR en tiempo real, incluidos cebadores SYBR Green, sondas TaqMan y balizas moleculares.