Los marcadores de ADN asociados a sitios de restricción (RAD) son un tipo de marcador genético que son útiles para el mapeo de asociaciones, el mapeo de QTL , la genética de poblaciones , la genética ecológica y la genética evolutiva. El uso de marcadores RAD para el mapeo genético a menudo se denomina mapeo RAD. Un aspecto importante de los marcadores y el mapeo RAD es el proceso de aislamiento de etiquetas RAD, que son las secuencias de ADN que flanquean inmediatamente cada instancia de un sitio de restricción particular de una enzima de restricción en todo el genoma. [1] Una vez que se han aislado las etiquetas RAD, se pueden usar para identificar y genotipar polimorfismos de secuencia de ADN principalmente en forma de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) . [1] Los polimorfismos que se identifican y genotipan mediante el aislamiento y análisis de etiquetas RAD se denominan marcadores RAD. Aunque la genotipificación por secuenciación presenta un enfoque similar al método RAD-seq, difieren en algunos aspectos sustanciales. [2] [3] [4]
El uso de secuencias de ADN flanqueantes alrededor de cada sitio de restricción es un aspecto importante de las etiquetas RAD. [1] La densidad de las etiquetas RAD en un genoma depende de la enzima de restricción utilizada durante el proceso de aislamiento. [5] Existen otras técnicas de marcadores de sitios de restricción, como RFLP o polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados (AFLP), que utilizan el polimorfismo de longitud de fragmentos causado por diferentes sitios de restricción, para la distinción del polimorfismo genético. El uso de secuencias de ADN flanqueantes en técnicas de etiquetas RAD se conoce como método de representación reducida. [2]
El procedimiento inicial para aislar las etiquetas RAD implicó digerir el ADN con una enzima de restricción particular, ligar los adaptadores biotinilados a los salientes, cortar aleatoriamente el ADN en fragmentos mucho más pequeños que la distancia promedio entre los sitios de restricción y aislar los fragmentos biotinilados utilizando perlas de estreptavidina . [1] Este procedimiento se utilizó inicialmente para aislar las etiquetas RAD para el análisis de microarrays . [1] [6] [7] Más recientemente, el procedimiento de aislamiento de la etiqueta RAD se ha modificado para su uso con secuenciación de alto rendimiento en la plataforma Illumina , que tiene el beneficio de tasas de error brutas muy reducidas y alto rendimiento. [5] El nuevo procedimiento implica digerir el ADN con una enzima de restricción particular (por ejemplo: SbfI, NsiI,…), ligar el primer adaptador, llamado P1, a los salientes, cortar aleatoriamente el ADN en fragmentos mucho más pequeños que la distancia promedio entre los sitios de restricción, preparar los extremos cortados en extremos romos y ligar el segundo adaptador (P2), y usar PCR para amplificar específicamente los fragmentos que contienen ambos adaptadores. Es importante destacar que el primer adaptador contiene un código de barras de secuencia de ADN corto, llamado MID (identificador molecular) que se usa como marcador para identificar diferentes muestras de ADN que se agrupan y secuencian en la misma reacción. [5] [8] El uso de secuenciación de alto rendimiento para analizar las etiquetas RAD se puede clasificar como secuenciación de representación reducida, que incluye, entre otras cosas, RADSeq (RAD-Sequencing). [2]
Una vez que se han aislado las etiquetas RAD, se pueden utilizar para identificar y genotipar polimorfismos de secuencia de ADN, como polimorfismos de un solo nucleótido (SNP). [1] [5] Estos sitios polimórficos se conocen como marcadores RAD. La forma más eficiente de encontrar etiquetas RAD es mediante secuenciación de ADN de alto rendimiento , [5] [8] denominada secuenciación de etiquetas RAD, secuenciación RAD, RAD-Seq o RADSeq.
Antes del desarrollo de las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento, los marcadores RAD se identificaban hibridando las etiquetas RAD con microarrays. [1] [6] [7] Debido a la baja sensibilidad de los microarrays, este enfoque solo puede detectar polimorfismos de secuencia de ADN que alteran los sitios de restricción y conducen a la ausencia de etiquetas RAD o polimorfismos sustanciales de secuencia de ADN que alteran la hibridación de las etiquetas RAD. Por lo tanto, la densidad de marcadores genéticos que se puede lograr con microarrays es mucho menor que la que es posible con la secuenciación de ADN de alto rendimiento. [9]
Los marcadores RAD se implementaron primero utilizando microarrays y luego se adaptaron para NGS (Next-Generation-Sequencing). [9] Fue desarrollado conjuntamente por los laboratorios de Eric Johnson y William Cresko en la Universidad de Oregon alrededor de 2006. Confirmaron la utilidad de los marcadores RAD al identificar puntos de ruptura de recombinación en D. melanogaster y al detectar QTL en espinosos de tres espinas. [1]
En 2012 se sugirió un método de etiquetado RAD modificado llamado RADseq de doble digestión (ddRADseq). [10] [11] Al agregar una segunda enzima de restricción, reemplazando el corte aleatorio y un paso de selección de tamaño de ADN estricto, es posible realizar una genotipificación de población de bajo costo. Esta puede ser una herramienta especialmente poderosa para escaneos de genoma completo para selección y diferenciación de población o adaptación de población. [11]
Un estudio en 2016 presentó un nuevo método llamado hibridación RAD (hyRAD), [12] donde los fragmentos RAD biotinilados , que cubren una fracción aleatoria del genoma, se utilizan como cebos para capturar fragmentos homólogos de bibliotecas de secuenciación shotgun genómica . Los fragmentos de ADN se generan primero utilizando el protocolo ddRADseq aplicado a muestras frescas y se utilizan como sondas de captura de hibridación para enriquecer las bibliotecas shotgun en los fragmentos de interés. Este enfoque simple y rentable permite la secuenciación de loci ortólogos incluso de muestras de ADN altamente degradadas, abriendo nuevas vías de investigación en el campo de la museomía . Otra ventaja del método es que no depende de la presencia del sitio de restricción , lo que mejora la cobertura de loci entre muestras. La técnica se probó primero en muestras de museo y frescas de Oedaleus decorus , una especie de saltamontes paleártico , y luego se implementó en mielero regente , [13] artrópodos , [14] entre otras especies. Se desarrolló un protocolo de laboratorio para implementar hyRAD en aves. [15]