Una proteína fluorescente de unión a FMN ( FbFP ), también conocida como proteína fluorescente basada en LOV , es una proteína fluorescente pequeña e independiente del oxígeno que se une al mononucleótido de flavina (FMN) como cromóforo .
Se desarrollaron a partir de receptores de luz azul (los llamados dominios LOV ) que se encuentran en plantas y varias bacterias. [1] Complementan a los derivados y homólogos de GFP y se caracterizan particularmente por su independencia del oxígeno molecular y su pequeño tamaño. Los FbFP absorben luz azul y emiten luz en el rango espectral cian-verde.
Los dominios LOV son una subclase de dominios PAS y se identificaron por primera vez en plantas como parte de la fototropina , que desempeña un papel esencial en el crecimiento de la planta hacia la luz. [2] Se unen de forma no covalente al mononucleótido de flavina (FMN) como cofactor. Debido al FMN unido, los dominios LOV exhiben una fluorescencia intrínseca, que sin embargo es muy débil. Tras la iluminación con luz azul, los dominios LOV experimentan un fotociclo, durante el cual se forma un enlace covalente entre un residuo de cisteína conservado y el FMN. Esto provoca un cambio conformacional en la proteína que es necesario para la propagación de la señal y también conduce a la pérdida de fluorescencia. El enlace covalente es energéticamente desfavorable y se escinde con una constante de tiempo específica de la proteína que varía de segundos a horas. [3] [4] [5] Para aprovechar mejor las propiedades de fluorescencia de estas proteínas, se eliminó el fotociclo natural de estos dominios LOV intercambiando la cisteína conservada por una alanina a nivel genético. De este modo, al ser irradiada con luz azul, la proteína permanece en estado fluorescente y también exhibe una fluorescencia más brillante. [1]
Las primeras FbFP generadas de esta manera se optimizaron posteriormente mediante diferentes métodos de mutagénesis. Se mejoró especialmente el brillo [6] [7] [8] , pero también la fotoestabilidad [2] de las proteínas y se modificaron sus características espectrales. [8]
Por lo general, las FbFP tienen un máximo de excitación a una longitud de onda de aproximadamente 450 nm (luz azul) y un segundo pico de excitación distinto alrededor de 370 nm (luz UV-A). El pico de emisión principal está a aproximadamente 495 nm, con un hombro alrededor de 520 nm. Una variante de Pp2FbFP (Q116V) exhibe un desplazamiento hacia el azul de 10 nm tanto en los espectros de excitación como de emisión. [8] Las variantes diseñadas racionalmente de iLOV y CagFbFP exhiben desplazamientos hacia el rojo de 6 y 7 nm, respectivamente. [9]
Las propiedades fotofísicas de las FbFP están determinadas por el propio cromóforo y su entorno químico en la proteína. El coeficiente de extinción (ε) es de alrededor de 14.200 M −1 cm −1 a 450 nm para todas las FbFP descritas, que es ligeramente superior al de la FMN libre (ε = 12.200 M −1 cm −1 [10] ). El rendimiento cuántico de fluorescencia (Φ) varía significativamente entre diferentes FbFP y oscila entre 0,2 (phiLOV2.1) y 0,44 (EcFbFP e iLOV). [6] [8] Esto representa un aumento de casi el doble en comparación con la FMN libre (Φ = 0,25 [8] ).
La diferencia con la FMN libre es aún más significativa en el caso de la fotoestabilidad, la resistencia de las proteínas a blanquearse durante la irradiación prolongada e intensa con luz azul. Basándose en el tiempo de semidesvanecimiento (el tiempo que tarda en reducirse la intensidad de fluorescencia inicial al 50% tras la iluminación), la variante genéticamente modificada phiLOV2.1 [2] es aproximadamente 40 veces más estable que el FMN libre. Este efecto estabilizador se puede observar para casi todas las FbFP, aunque normalmente está en el rango de 5x - 10x. [8]
La vida media de fluorescencia de las FbFP está en el rango de 3,17 (Pp2FbFP) y 5,7 ns (p. ej., EcFbFP). [8] Por lo tanto, son mucho más largas que las de los derivados de GFP, que normalmente están entre 1,5 y 3 ns. [11] [12]
Por lo tanto, las FbFP son muy adecuadas como dominios donantes en sistemas de transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) junto con derivados de GFP como YFP como dominios aceptores.
La principal ventaja de las FbFP sobre las GFP es su independencia del oxígeno molecular. Dado que todos los derivados y homólogos de las GFP requieren oxígeno molecular para la maduración de su cromóforo, estas proteínas fluorescentes tienen un uso limitado en condiciones anaeróbicas o hipóxicas. [13]
Dado que las FbFP se unen a FMN como cromóforo, que se sintetiza independientemente del oxígeno molecular, su señal de fluorescencia no difiere entre condiciones aeróbicas y anaeróbicas. [1] [14]
Otra ventaja es el pequeño tamaño de las FbFP, que normalmente está entre 100 y 150 aminoácidos . Esto es aproximadamente la mitad del tamaño de las GFP (238 aminoácidos). Por ejemplo, se podría demostrar que esto las convierte en etiquetas superiores para monitorear infecciones por el virus del mosaico del tabaco en hojas de tabaco. [6]
Debido a su extraordinariamente larga vida media de fluorescencia de hasta 5,7 ns, también son muy adecuadas para el uso como dominios donantes en sistemas FRET junto con, por ejemplo, YFP (ver propiedades fotofísicas). Por ejemplo, se utilizó una fusión de EcFbFP y YFP para desarrollar el primer biosensor de fluorescencia codificado genéticamente para oxígeno (FluBO) [15].
La principal desventaja en comparación con las variantes de GFP es su menor brillo (el producto de ε y Φ). El EGFP comúnmente utilizado (ε = 55.000 M −1 cm −1 ; Φ = 0,60 [16] ) por ejemplo es aproximadamente cinco veces más brillante que EcFbFP.
Otra desventaja de los FbFP es la falta de variantes de color para etiquetar y distinguir múltiples proteínas en una sola célula o tejido. El mayor cambio espectral informado para FbFP hasta ahora es de 10 nm. Aunque esta variante (Pp2FbFP Q116V) puede distinguirse visualmente de las demás con el ojo humano, [8] las diferencias espectrales son demasiado pequeñas para los filtros de microscopía de fluorescencia.