El plegamiento descendente es un proceso en el que una proteína se pliega sin encontrar ninguna barrera macroscópica significativa de energía libre . Es una predicción clave de la hipótesis del embudo de plegamiento de la teoría del paisaje energético de las proteínas.
Se predice que el plegamiento descendente ocurre en condiciones de sesgo nativo extremo , es decir, a bajas temperaturas o en ausencia de desnaturalizantes . Esto corresponde al escenario de tipo 0 [ aclaración necesaria ] en la teoría del paisaje energético . A temperaturas o concentraciones de desnaturalizantes cercanas a sus puntos medios aparentes , las proteínas pueden cambiar del plegamiento descendente al plegamiento de dos estados, la transición de tipo 0 a tipo 1 .
El plegamiento global descendente (o plegamiento de un estado ) es otro escenario en el que la proteína se pliega en ausencia de una barrera de energía libre en todas las condiciones. En otras palabras, hay una distribución unimodal de la población a todas las temperaturas y concentraciones de desnaturalizantes, lo que sugiere una transición de desdoblamiento continua en la que diferentes conjuntos de estructuras se pueblan en diferentes condiciones. Esto contrasta con el plegamiento de dos estados, que supone solo dos conjuntos (plegado y desplegado) y una transición de desdoblamiento abrupta.
Se prevé que las barreras de energía libre en el plegamiento de proteínas sean pequeñas porque surgen como resultado de la compensación entre términos energéticos y entrópicos grandes . La falta de sincronización entre la ganancia de energía estabilizadora y la pérdida de entropía conformacional da como resultado un plegamiento de dos estados, mientras que una sincronización entre estos dos términos a medida que avanza el plegamiento da como resultado un plegamiento descendente.
Las estructuras de estado de transición en el plegamiento de dos estados no son accesibles experimentalmente (por definición, son las menos pobladas a lo largo de la coordenada de reacción ), pero los subconjuntos de plegamiento en los procesos de plegamiento descendente se pueden distinguir teóricamente mediante espectroscopia . [1] [2 ] Se ha demostrado experimentalmente que la proteína BBL de 40 residuos, que es un dominio de plegamiento independiente de la subunidad E2 del complejo multienzimático 2-oxoglutarato deshidrogenasa de E. coli , se pliega globalmente cuesta abajo. [3] [4] Además, se ha demostrado que un mutante de la proteína represora lambda cambia de estado descendente a dos al cambiar las condiciones de temperatura/disolvente. Sin embargo, el estado de BBL como proteína de plegamiento descendente y, por extensión, la existencia de plegadores descendentes naturales, ha sido controvertido. [5] [6] [7] La controversia actual surge del hecho de que la única forma en que una proteína puede ser etiquetada como de dos estados o cuesta abajo es analizando los datos experimentales con modelos que tratan explícitamente estas dos situaciones, es decir, permitiendo que varíen las alturas de las barreras. Desafortunadamente, la mayoría de los datos experimentales hasta ahora se han analizado con un modelo químico simple de dos estados. En otras palabras, se ha asumido la presencia de una barrera de energía libre bastante grande, descartando la posibilidad de identificar el plegamiento de proteínas cuesta abajo o globalmente cuesta abajo. Esto es crítico porque cualquier curva de desdoblamiento sigmoide , independientemente del grado de cooperatividad , se puede ajustar a un modelo de dos estados. Cinéticamente, la presencia de una barrera garantiza un exponencial único, pero no al revés. [8] Sin embargo, en algunas proteínas como la fosfoglicerato quinasa de levadura y una ubiquitina humana mutante , se han observado cinéticas no exponenciales que sugieren un plegamiento cuesta abajo. [9]
Una solución propuesta para estos problemas es desarrollar modelos que puedan diferenciar entre las diferentes situaciones e identificar criterios experimentales simples pero robustos para identificar proteínas de plegamiento descendente. Estos criterios se describen a continuación.
Un análisis basado en una extensión del modelo de plegamiento de proteínas de Zwanzig [10] indica que las proteínas con plegamiento descendente global deberían revelar diferentes temperaturas de fusión aparentes (Tms) cuando se monitorean con diferentes técnicas. [2] Esto se confirmó experimentalmente en la proteína BBL mencionada anteriormente. El desdoblamiento seguido por calorimetría diferencial de barrido (DSC), dicroísmo circular (CD), transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) y fluorescencia revelaron diferentes temperaturas de fusión aparentes. [3] También se observó una temperatura de fusión dependiente de la longitud de onda en los experimentos de CD. Los datos analizados con un modelo mecánico estadístico basado en la estructura dieron como resultado una distribución de población unimodal a todas las temperaturas, lo que indica un proceso de desdoblamiento continuo estructuralmente desacoplado. La cuestión crucial en tales experimentos es utilizar sondas que monitoreen diferentes aspectos de la estructura. Por ejemplo, la DSC proporciona información sobre los cambios de capacidad térmica (y, por lo tanto, entalpía ) asociados con el desdoblamiento, la fluorescencia sobre el entorno inmediato del fluoróforo, la FRET sobre las dimensiones promedio de la molécula y la CD sobre la estructura secundaria .
Una prueba más estricta implicaría seguir los desplazamientos químicos de todos y cada uno de los átomos de la molécula mediante resonancia magnética nuclear (RMN) en función de la temperatura/desnaturalizante. Aunque requiere mucho tiempo, este método no requiere ningún modelo específico para la interpretación de los datos. Los Tms de todos los átomos deberían ser idénticos dentro del error experimental si la proteína se pliega de manera biestatal. Pero para una proteína que se pliega globalmente cuesta abajo, las curvas de desdoblamiento deberían tener Tms muy diferentes. Se encontró que el comportamiento de desdoblamiento atómico de BBL seguía este último, mostrando una gran dispersión en los Tms consistente con el comportamiento global cuesta abajo. [4] Se encontró que los Tms de algunos átomos eran similares a los de la Tm global (obtenida a partir de una técnica de baja resolución como CD o fluorescencia), lo que indica que se debe seguir el desdoblamiento de múltiples átomos, en lugar de unos pocos como se hace frecuentemente en tales experimentos. El comportamiento promedio de desdoblamiento atómico fue sorprendentemente similar al del CD, lo que subraya el hecho de que las curvas de desdoblamiento de experimentos de baja resolución son representaciones altamente simplificadas de un comportamiento más complejo.
Las líneas base que se utilizan con frecuencia en los ajustes de dos estados corresponden a las fluctuaciones en el pozo plegado o desplegado. Son puramente empíricas, ya que hay poca o ninguna información sobre cómo cambian las propiedades de los estados plegados o desplegados con la temperatura o el desnaturalizante químico . Esto asume incluso más importancia en el caso de los experimentos de DSC, ya que los cambios en la capacidad térmica corresponden tanto a las fluctuaciones en el conjunto de proteínas como a la exposición de residuos hidrofóbicos al desplegarse. Los perfiles de DSC de muchas proteínas pequeñas de plegado rápido son amplios, con pendientes pronunciadas previas a la transición. Los ajustes de dos estados a estos perfiles dan como resultado el cruce de líneas base, lo que indica que la suposición de dos estados ya no es válida. Esto fue reconocido por Munoz y Sanchez-Ruiz, lo que resultó en el desarrollo del modelo de barrera variable. [11] En lugar de intentar una inversión libre de modelo del perfil de DSC para extraer la función de densidad de probabilidad subyacente , asumieron una energía libre funcional específica con uno o dos mínimos (similar a la teoría de Landau de transiciones de fase ) permitiendo así la extracción de alturas de barrera de energía libre. Este modelo es el primero de su tipo en bioquímica física que permite la determinación de alturas de barrera a partir de experimentos de equilibrio . El análisis del perfil DSC de BBL con este modelo dio como resultado una altura de barrera cero, es decir, un plegamiento descendente, lo que confirma el resultado anterior del modelo mecánico estadístico. Cuando se aplicó el modelo de barrera variable a un conjunto de proteínas para las que están disponibles tanto los datos de velocidad como de DSC, se obtuvo una correlación muy alta de 0,95 entre las velocidades y las alturas de barrera. [12] Muchas de las proteínas examinadas tenían barreras pequeñas (<20 kJ/mol) con un cruce de línea base evidente para las proteínas que se pliegan más rápido que 1 ms. Esto contrasta con la suposición tradicional de que la barrera de energía libre entre los estados plegado y desplegado es grande.
Debido a que el plegamiento descendente es difícil de medir experimentalmente, se han realizado simulaciones de Monte Carlo y dinámica molecular en proteínas de plegamiento rápido para explorar su cinética de plegamiento. Las proteínas cuya tasa de plegamiento está en o cerca del "límite de velocidad" de plegamiento, cuyas escalas de tiempo hacen que su plegamiento sea más accesible a los métodos de simulación, pueden plegarse más comúnmente cuesta abajo. [13] Los estudios de simulación de la proteína BBL implican que su rápida tasa de plegamiento y su barrera de energía muy baja surgen de una falta de cooperatividad en la formación de contactos nativos durante el proceso de plegamiento; es decir, un orden de contacto bajo . El vínculo entre la falta de cooperatividad y el bajo orden de contacto también se observó en el contexto de simulaciones de red de Monte Carlo [14] Estos datos sugieren que el número promedio de "contactos no locales" por residuo en una proteína sirve como un indicador de la altura de la barrera, donde los valores de contacto no local muy bajos implican plegamiento cuesta abajo. [15] Las simulaciones de grano grueso de Knott y Chan también respaldan la observación experimental del plegamiento cuesta abajo global en BBL. [16] Un estudio más reciente que utilizó simulación de dinámica molecular a pH constante (CpHMD) ha reconciliado los mecanismos opuestos de plegamiento descendente y de dos estados y descubrió que la barrera de plegamiento desaparece en condiciones de pH ácido, lo que conduce al plegamiento descendente. [17]