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Secuenciación de parches

La secuenciación por parche (patch-seq) es una modificación de la técnica de fijación por parche que combina la caracterización electrofisiológica , transcriptómica y morfológica de neuronas individuales. En este enfoque, se recolecta el citoplasma de la neurona y se procesa para la secuenciación de ARN después de realizar registros electrofisiológicos en él. Al mismo tiempo, la célula se llena con un colorante que permite la reconstrucción morfológica posterior.

Fondo

La tipificación de células neuronales requiere la captura simultánea de múltiples modalidades de datos

Diagrama Patch-Seq que ilustra los tres tipos de datos principales que obtenemos de la técnica: Propiedades electrofisiológicas, análisis del transcriptoma y reconstrucción morfológica.
Microcircuito cortical

Si bien las propiedades eléctricas de una neurona son importantes para definir un tipo de célula, su morfología , los tipos de neurotransmisores liberados, los receptores de neurotransmisores expresados ​​​​en las sinapsis, así como la ubicación de la neurona en el sistema nervioso y su circuito local son igualmente importantes. Las neuronas vienen en una gran diversidad de formas con muchas diferencias en los cuerpos celulares (soma) , dendritas y axones . La posición de las dendritas determina de qué otras neuronas recibe una célula su entrada y su forma puede tener un impacto masivo en cómo una neurona responde a esta entrada. Del mismo modo, los objetivos del axón de una neurona determinan sus salidas. Los tipos de sinapsis formadas entre los axones y las dendritas de las neuronas también son igualmente importantes. [1] Por ejemplo, en el microcircuito cortical de la corteza de los mamíferos, retratado a la derecha, las células tienen patrones de proyección altamente específicos tanto dentro del circuito local como en regiones corticales y no corticales. La geometría dendrítica también influye en el comportamiento eléctrico de las neuronas, y tiene una influencia enorme en la forma en que las dendritas procesan la información en forma de potenciales postsinápticos . La geometría desordenada y los patrones de proyección se han relacionado con un conjunto diverso de afecciones psiquiátricas y neurológicas, incluido el autismo y la esquizofrenia, aunque aún no se comprende la relevancia conductual de estos fenotipos. [2] Los tipos de células neuronales parecían variar a menudo de forma continua entre sí. Los intentos anteriores de clasificación neuronal por propiedades morfoeléctricas se han visto limitados por el uso de metodologías incompatibles y la selección de diferentes líneas celulares. [3]

Con la llegada de la secuenciación de ARN de células individuales (scRNA-seq), se esperaba que existieran genes que se expresaran de manera consistente solo en neuronas con propiedades definidas clásicamente específicas. Estos genes servirían como marcadores celulares. Esto proporcionaría un mejor medio para delinear los tipos de neuronas de manera rápida y fácil utilizando solo la secuenciación de ARNm. Sin embargo, parecía que scRNA-seq solo servía para reforzar el hecho de que las definiciones de tipo celular demasiado rígidas no siempre son la mejor manera de caracterizar las neuronas. [4] Además, la expresión génica está regulada dinámicamente, variando en varias escalas de tiempo en respuesta a la actividad en formas específicas del tipo celular para permitir la plasticidad neuronal. [5] [6] Al igual que otros tejidos, también deben considerarse los procesos de desarrollo. [7] Hacer coincidir los resultados de scRNA-seq con los tipos de células neuronales definidos clásicamente es muy desafiante por todas estas razones [8] y, además, el RNA-seq de células individuales tiene sus propios inconvenientes para la clasificación neuronal. Aunque la secuenciación de ARNm permite estudiar los patrones de expresión génica de neuronas individuales, altera el tejido para aislar células individuales y, por lo tanto, es difícil inferir la posición original de una neurona en el tejido u observar su morfología. Vincular la información de secuenciación a un subtipo neuronal, definido previamente por características electrofisiológicas y morfológicas, es un proceso lento y complicado. [9] La captura e integración simultánea de múltiples tipos de datos mediante la secuenciación de parches la hace ideal para la clasificación neuronal, ya que descubre nuevas correlaciones entre la expresión génica, las propiedades electrofisiológicas y morfológicas y la función neuronal. [10] Esto hace que la secuenciación de parches sea un método verdaderamente interdisciplinario, que requiere la colaboración entre especialistas en electrofisiología, secuenciación e imágenes. [10]

Preparación y elección del sistema modelo

La técnica Patch-seq se puede realizar en cualquier sistema modelo, incluido el cultivo celular de neuronas. Las neuronas para cultivo se pueden recolectar de tejido neuronal y luego disociarlas [11] o crearlas a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) , neuronas que se han desarrollado a partir de líneas de células madre humanas. [12] La preparación de cultivos celulares es la más fácil para aplicar la técnica Patch-Clamp y le da al experimentador el control sobre los ligandos a los que se expone la neurona, por ejemplo, hormonas o neurotransmisores. Sin embargo, el beneficio del control experimental total también significa que las neuronas no están sujetas al entorno natural al que estarían expuestas durante el desarrollo. Como se mencionó anteriormente, la posición en la que se extienden sus dendritas y axones, así como la posición de la neurona con una estructura cerebral, es increíblemente importante para comprender su papel dentro de un circuito. Existen muchas preparaciones para cortes cerebrales de diferentes especies animales. [13] [14] Debido a la presencia de células o desechos en el camino de la pipeta y una célula objetivo, la preparación deberá modificarse ligeramente; a menudo se aplica una ligera presión positiva a la pipeta para evitar que se formen sellos no deseados. Si es de interés comprender cómo se relaciona el comportamiento con la dinámica de los eventos neuronales, también es posible registrarlos in vivo . Aunque la adaptación de la pinza de parche para estudios in vivo puede ser muy difícil por razones mecánicas, especialmente durante una tarea de comportamiento, pero se ha hecho. [15] Se han desarrollado métodos automatizados de pinza de parche in vivo . [16] Existe muy poca diferencia entre las preparaciones para especies de mamíferos, aunque la mayor diversidad de tamaños neuronales en la corteza de primates no humanos y de primates puede requerir el uso de diferentes diámetros de punta y presiones para formar sellos sin matar neuronas objetivo. [10] La secuencia de parche también se aplica a estudios no neuronales, como células pancreáticas o cardíacas. [17]

Flujo de trabajo de secuenciación de parches

Después de elegir un sistema modelo y un tipo de preparación, los experimentos de patch-seq tienen un flujo de trabajo similar. Primero se establece un sello entre la célula y la pipeta para que pueda tener lugar el registro y la recolección. Las células se pueden llenar con una etiqueta fluorescente para la obtención de imágenes durante el registro. [18] Después del registro, se aplica presión negativa para capturar el citosol y, a menudo, el núcleo para la secuenciación. Este proceso se repite hasta que las células en la preparación se han degradado y no vale la pena recopilar datos de ellas. El análisis post-hoc de los datos de imágenes permite la reconstrucción morfológica. De la misma manera, a menudo también se requiere un procesamiento post-hoc complejo de los datos transcriptómicos para manejar una gran cantidad de confusiones cuando se recolectan contenidos citosólicos de las células a través de la pipeta. [19] [20] [21] En las etapas iniciales, antes de formar el sello entre la pipeta y la célula, las rebanadas de tejido se preparan utilizando un vibratomo compresstome . Para obtener secciones delgadas de tejido, se utilizan estos dispositivos. Este dispositivo asegura que las células objetivo sean accesibles para la sujeción del parche. La calidad y precisión de los cortes de tejido son importantes para el éxito del experimento de patch-seq. El grosor y la condición de estos cortes de tejido influyen en la eficiencia de la focalización celular y la calidad del sellado del parche. Una preparación adecuada de los cortes es esencial para el éxito general del flujo de trabajo de patch-seq. [22]

Formación del sello entre la pipeta y la celda.

La pipeta de parche está diseñada para el registro de células completas, por lo que su diámetro de apertura es mayor que el de los experimentos realizados para examinar canales iónicos individuales. En la mayoría de los casos, se pueden utilizar protocolos de pinza de parche estándar, aunque existen algunas pequeñas modificaciones que dependen de la situación en la pipeta y la solución interna. Se puede utilizar un diámetro aún más amplio para facilitar la aspiración del interior de la célula en la pipeta, pero es posible que sea necesario ajustarlo en función del tipo de célula objetivo. [23] Se aplica presión negativa para mejorar el sellado, lo que será mejor para el registro y evitará la fuga de líquido intracelular y la contaminación después o durante la recolección de contenidos celulares para secuenciación. Durante el registro, la biotina se puede difundir en la célula a través de la pipeta para la obtención de imágenes y la posterior reconstrucción morfológica. [18]

Registro electrofisiológico

Una vez que se ha establecido un sello, las células se someten a diferentes regímenes de estimulación utilizando la pinza de voltaje , como rampas, pulsos cuadrados e inyecciones de corriente ruidosas. Se registran las características de la membrana del cuerpo celular, incluido el potencial de membrana en reposo y el potencial umbral . También se registran las características observadas a partir de los potenciales de acción (PA) generados , como el ancho del PA, la amplitud del PA, la amplitud posterior a la despolarización y la amplitud posterior a la hiperpolarización. [3] [9] Los registros de células completas se realizan utilizando pipetas de recodificación de parche llenas de un pequeño volumen de solución intracelular (para evitar la dilución del ARN), quelantes de calcio, transportadores de ARN e inhibidores de la ARNasa. [10] La adición de inhibidores de la ARNasa, como EGTA, mejora el análisis del transcriptoma al preservar el ARN de mayor calidad de las muestras. [9] El tiempo de registro puede tardar entre 1 y 15 minutos sin afectar la estructura de la neurona debido a la hinchazón, y los valores más bajos aumentan el rendimiento de la técnica. [14] Los datos se registran y analizan con software comercial o de código abierto como MIES, [3] [24] PATCHMASTER, [25] pCLAMP, [26] WaveSurfer, [27] entre otros.

Las neuronas se estimulan previamente para verificar su potencial de membrana en reposo y estabilizar su línea base a lo largo y dentro de los experimentos. Luego, las células se estimulan con corrientes de rampa y cuadradas, y se registran y miden sus propiedades electrofisiológicas. Después del estímulo, el potencial de membrana debe volver al valor de línea base para que los registros sean consistentes y robustos. Se utiliza presión negativa al final de los registros para recuperar la estabilidad de la membrana. Las mediciones deben satisfacer estas condiciones para que se las considere para un análisis posterior. [14] Durante el registro, es necesario mantener la viabilidad celular, ya que el bloqueo de la membrana es estresante para la célula.

Es fundamental disponer de cortes cerebrales sanos, agudos o vivos, para realizar registros electrofisiológicos, ya que la salud de la neurona afecta significativamente la calidad de los datos obtenidos. Los cortes cerebrales sanos se preparan normalmente utilizando herramientas como el vibratomo Compresstome, lo que garantiza condiciones óptimas para realizar registros precisos y fiables. [28]

Extracción de núcleo

Se utiliza presión negativa para mover el núcleo cerca de la punta de la pipeta mientras se mueve el electrodo cerca del centro del soma. El sistema modelo en cuestión afectará la presión negativa que se aplicará. En primates humanos y no humanos, la viabilidad celular es más difícil de asegurar. Las variaciones más grandes en el tamaño neuronal en comparación con los modelos de roedores significan una mayor variabilidad en la cantidad de presión negativa que se necesita aplicar para extraer el citosol y el núcleo. [10] Después de la recuperación, la pipeta se retrae lentamente mientras se mantiene la presión negativa hasta que la membrana que rodea el núcleo se desprende de la célula y la punta forma un sello de membrana. El sello de membrana atrapa el contenido extraído en la pipeta y evita la contaminación durante la extracción para la secuenciación antes de preparar la pipeta para otra grabación. La construcción del sello se puede observar eléctricamente por el aumento de la resistencia (MΩ). [14] El proceso de recuperación es lento, a menudo toma alrededor de diez minutos, ya que se necesita precisión para no reventar la célula. [14]

Transcriptómica

El análisis de secuenciación de ARN se realiza utilizando el núcleo y el citosol extraídos de las neuronas registradas. [9] [14] El ARN se amplifica a ADNc de longitud completa y se construyen bibliotecas para la secuenciación. Los análisis que incluyen el núcleo no solo tienen mayores rendimientos de ARNm, sino que también aumentan la calidad de los datos. [3]

Las muestras presentan un alto grado de variabilidad en el contenido de ARN, en algunos casos incluyendo contaminación de ARN de células adyacentes como astrocitos u otros tipos de neuronas. La calidad se evalúa mediante genes marcadores definidos, que indican si el contenido de ARN incluye dianas de la clase celular de interés ( en marcador) y carece de marcadores de contaminación ( fuera de marcador). [14] Se utilizan varias métricas para juzgar la calidad del ARN recolectado.

Reconstrucción morfológica

La forma y la estructura de las neuronas, como la arborización dendrítica/axonal, la geometría axonal, los contactos sinápticos y la ubicación del soma, se utilizan para la clasificación del tipo neuronal. En preparaciones de cortes agudos o in vivo, se observa la posición laminar, ya que también tiene consecuencias funcionales importantes. La tinción con biotina se realiza durante el registro electrofisiológico de las neuronas. [30] Alternativamente, la rodamina agregada fuera de la célula permite imaginar la célula viva antes del registro. [31] La formación de imágenes se realiza mediante imágenes en mosaico bidimensionales mediante transmisión de campo claro y canales de fluorescencia en células individuales y luego se procesa en software comercial o de código abierto. [14] Se pueden obtener imágenes de mayor resolución a partir de neuronas cultivadas en comparación con cortes agudos, lo que produce reconstrucciones morfológicas de mayor calidad. [10]

La reconstrucción 3D post-hoc se realiza mediante software de procesamiento de imágenes como TReMAP, [32] Mozak, [33] o Vaa3D. [34] La calidad del resultado depende de una variedad de factores, desde el tiempo de registro electrofisiológico hasta el procedimiento de extracción del núcleo. Las células reconstruidas se clasifican en cuatro niveles de calidad según su integridad y la integridad de la estructura. Alta calidad si los somas y los procesos son completamente visibles y es posible una reconstrucción digital adecuada, calidad media si los somas y algunos procesos son visibles pero no son compatibles con la reconstrucción 3D, axón insuficiente donde las dendritas están llenas de biotina pero los axones están débilmente teñidos, y rellenos fallidos que carecen de tinción del soma probablemente debido al hundimiento de la estructura después de la extracción nuclear. [14]

Análisis de datos posteriores

El diseño del flujo de trabajo para procesar y combinar los datos multimodales resultantes depende de la pregunta de investigación particular a la que se aplica el patch-seq. En los estudios de tipificación celular, los datos deben compararse con los estudios scRNA-seq existentes con tamaños de muestra más grandes (del orden de miles de células en comparación con decenas o cientos) y, por lo tanto, mayor poder estadístico para la identificación del tipo de célula utilizando solo datos transcriptómicos. Los métodos basados ​​en correlación son suficientes para este paso. [3] [35] Los métodos de reducción de dimensionalidad como la incrustación de vecinos estocásticos distribuidos en T o la aproximación y proyección de colector uniforme se pueden utilizar para visualizar la posición de los datos recopilados en un atlas de referencia de datos scRNA-seq de mayor calidad. [36] El aprendizaje automático se puede aplicar para relacionar los datos de expresión génica con los datos morfológicos y electrofisiológicos. Los métodos para hacerlo incluyen autocodificadores , [37] redes de cuello de botella , [38] u otros métodos de reducción de rango. [36] La inclusión de datos morfológicos ha demostrado ser un desafío, ya que se trata de una tarea de visión por computadora , un problema notoriamente complicado en el aprendizaje automático . Es difícil representar datos de imágenes de las reconstrucciones morfológicas como un vector de características para incluir en el análisis. [10]

Aplicaciones

El conjunto de datos integrados de patch-seq permite una caracterización integral de los tipos de células, particularmente en neuronas. Los neurocientíficos han aplicado esta técnica a una variedad de experimentos y protocolos para descubrir nuevos subtipos de células basados ​​en correlaciones entre datos transcriptómicos y propiedades morfoeléctricas neuronales. Aplicando el aprendizaje automático a los datos de patch-seq es posible estudiar los datos transcriptómicos y vincularlos a sus respectivas propiedades morfoeléctricas. [10] Tener una verdad fundamental confirmada para una clasificación robusta de los tipos de células permite a los investigadores observar la función de tipos y subtipos de neuronas específicos en procesos complejos como el comportamiento, el lenguaje y los procesos subyacentes en enfermedades neurológicas y psiquiátricas. La comparación de la proteómica con la transcriptómica ha demostrado que los datos transcripcionales no necesariamente se traducen en la misma expresión de proteínas [39] y, de la misma manera, tener la capacidad de observar la verdad fundamental del fenotipo de una neurona a partir de métodos de clasificación clásicos combinados con datos transcriptómicos es importante para la neurociencia. Se han encontrado experimentos de patch-seq que respaldan los resultados transcriptómicos, pero otros han encontrado casos en los que la morfología de tipos celulares similares definidos transcriptómicamente en diferentes regiones cerebrales no coincidía. [10] La técnica es particularmente adecuada para la neurociencia, pero en general cualquier tejido en el que sea de interés conocer simultáneamente la electrofisiología, la morfología y la transcriptómica encontraría uso para patch-seq. Por ejemplo, patch-seq también se ha aplicado a tejidos no neuronales, como los islotes pancreáticos, para estudiar la diabetes. [17]

Conjuntos de datos Patch-Seq integrados en algoritmos de aprendizaje automático para predecir la morfología neuronal y las propiedades electrofisiológicas a partir de datos del transcriptoma obtenidos de la secuenciación de una sola célula.

Limitaciones

La limitación más grave de patch-seq es una limitación compartida por las técnicas de patch clamp en general, que es el requisito de alta fidelidad y trabajo manual diestro. El patch clamping se ha descrito como una forma de arte y requiere práctica para perfeccionar la técnica. Por lo tanto, no solo es un trabajo intensivo, sino que también lleva años de entrenamiento perfeccionar la técnica. [42] [43] Hasta la fecha, el estudio patch-seq más grande se realizó en cortes corticales agudos de la corteza visual primaria de ratón . Se parchearon y secuenciaron un poco más de 4000 neuronas y el esfuerzo requirió una enorme cantidad de trabajo manual. [14] La mayoría de los demás conjuntos de datos se recopilaron de decenas o cientos de células. Significativamente menos que las células recolectadas para secuenciar disociando el tejido. [10] Sin embargo, ninguna otra técnica de registro electrofisiológico puede igualar la resolución temporal de patch-seq o la capacidad de caracterizar corrientes iónicas específicas ni ofrecer la capacidad de producir una pinza de voltaje. Por estas razones, la automatización de la técnica es un área de investigación activa en muchos laboratorios de todo el mundo para aplicaciones que utilizan fijación de parche, incluido patch-seq.

La reconstrucción morfológica mediante imágenes digitales es otra limitación de la técnica, con tasas de éxito a menudo inferiores al 50 %. [14] La integración adecuada de la enorme cantidad de imágenes con altas cantidades de ruido y la alteración estructural causada por la extracción del núcleo la convierte en un desafío computacional en neurociencia. Se están desarrollando nuevos métodos de rastreo automático, pero la calidad sigue siendo baja. [44]

Direcciones futuras

Integración de otras tecnologías de secuenciación, proteómica y manipulación genética de células individuales

Hasta ahora, la única tecnología de secuenciación utilizada ha sido la secuenciación de ARNm. La inclusión de otras modalidades también aumentaría el número de " ómicas " incluidas en los datos generados. Por ejemplo, una técnica para separar el ARNm del ADN podría permitir estudiar modificaciones en el ADN. [23] La accesibilidad de la cromatina podría juzgarse a partir de la metilación del ADN y utilizando inmunoprecipitación de ADN metilado y acetilación y desacetilación de histonas a partir de la secuenciación ChIP . Esto permitiría el estudio de la epigenética en experimentos de patch-seq. Del mismo modo, la separación de proteínas sería útil para juzgar las abundancias de proteínas, lo que permitiría la integración con la proteómica . CRISPR podría incluirse en la pipeta e inyectarse durante el registro para examinar los efectos de la mutación a nivel de una sola célula. [10]

Parcheo automático

El mayor obstáculo para el rendimiento de la secuenciación por parches es la mano de obra necesaria para la fijación de parches. La fijación de parches automatizada está empezando a convertirse lentamente en la norma, pero hasta el momento no ha alcanzado una adopción generalizada. Esto es así a pesar de que algunos equipos de fijación de rutas automáticas tienen una tasa de sellado y una tasa de recopilación de datos más altas que las de los humanos. La fijación de parches automatizada se puede realizar a ciegas sin información de imágenes, en lugar de depender de sensores de presión para proporcionar información a los algoritmos que guían a los equipos robóticos para formar sellos y registrarlos. Alternativamente, también existen algoritmos guiados por imágenes que permiten la selección de células marcadas con fluorescencia. Algunos sistemas se adaptan mejor a sistemas y preparaciones de modelos particulares. [43] [1]

Véase también

Referencias

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