Una bicapa lipídica modelo es cualquier bicapa ensamblada in vitro , a diferencia de la bicapa de las membranas celulares naturales o que cubre varias estructuras subcelulares como el núcleo . Se utilizan para estudiar las propiedades fundamentales de las membranas biológicas en un entorno simplificado y bien controlado, y cada vez más en biología sintética de abajo hacia arriba para la construcción de células artificiales . [1] Una bicapa modelo se puede hacer con lípidos sintéticos o naturales . Los sistemas modelo más simples contienen solo un único lípido sintético puro. Las bicapas modelo más relevantes fisiológicamente se pueden hacer con mezclas de varios lípidos sintéticos o naturales.
Existen muchos tipos diferentes de bicapas modelo, cada uno con ventajas y desventajas experimentales. El primer sistema desarrollado fue la membrana lipídica negra o bicapa “pintada”, que permite una caracterización eléctrica simple de las bicapas, pero tiene una vida útil corta y puede resultar difícil trabajar con ella. Las bicapas soportadas están ancladas a un sustrato sólido, lo que aumenta la estabilidad y permite el uso de herramientas de caracterización que no son posibles en una solución a granel. Estas ventajas se obtienen a costa de interacciones no deseadas con el sustrato que pueden desnaturalizar las proteínas de membrana .
El primer modelo de sistema bicapa desarrollado fue la bicapa “pintada”, también conocida como “membrana lipídica negra”. El término “pintada” se refiere al proceso mediante el cual se forman estas bicapas. Primero, se crea una pequeña abertura en una capa delgada de un material hidrófobo como el teflón . Normalmente, el diámetro de este orificio es de unas pocas decenas de micrómetros hasta cientos de micrómetros. Para formar una BLM, el área alrededor de la abertura primero se “prepinta” con una solución de lípidos disueltos en un solvente hidrófobo aplicando esta solución a través de la abertura con un pincel, una jeringa o un aplicador de vidrio. [2] El solvente utilizado debe tener un coeficiente de partición muy alto y debe ser relativamente viscoso para evitar la ruptura inmediata. El solvente más común utilizado es una mezcla de decano y escualeno .
Después de dejar que la abertura se seque, se añade una solución de sal (fase acuosa) a ambos lados de la cámara. A continuación, la abertura se "pinta" con una solución lipídica (generalmente la misma solución que se utilizó para la pintura previa). Se forma espontáneamente una monocapa lipídica en la interfaz entre las fases orgánica y acuosa a cada lado de la gota de lípido/disolvente. Debido a que las paredes de la abertura son hidrófobas, la solución de lípido/disolvente humedece esta interfaz, adelgazando la gota en el centro. Una vez que los dos lados de la gota se acercan lo suficiente, las monocapas lipídicas se fusionan, excluyendo rápidamente el pequeño volumen restante de solución. En este punto, se forma una bicapa en el centro de la abertura, pero queda un anillo significativo de disolvente en el perímetro. Este anillo es necesario para mantener la estabilidad actuando como un puente entre la bicapa de ~5 nm y la lámina de decenas de micrómetros de espesor en la que se hace la abertura. [3]
El término bicapa “negra” se refiere al hecho de que son oscuras en la luz reflejada porque el espesor de la membrana es de sólo unos pocos nanómetros, por lo que la luz que se refleja en la cara posterior interfiere destructivamente con la luz que se refleja en la cara frontal. De hecho, esta fue una de las primeras pistas de que esta técnica producía una membrana de espesor a escala molecular. [4] Las membranas lipídicas negras también son muy adecuadas para la caracterización eléctrica porque las dos cámaras separadas por la bicapa son accesibles, lo que permite la colocación sencilla de electrodos grandes. Por esta razón, la caracterización eléctrica es uno de los métodos más importantes utilizados junto con las bicapas lipídicas pintadas. Las mediciones simples indican cuándo se forma una bicapa y cuándo se rompe, ya que una bicapa intacta tiene una gran resistencia (>GΩ) y una gran capacitancia (~2 μF/cm 2 ). La caracterización eléctrica más avanzada ha sido particularmente importante en el estudio de los canales iónicos dependientes del voltaje . Las proteínas de membrana, como los canales iónicos, normalmente no se pueden incorporar directamente a la bicapa pintada durante la formación porque la inmersión en un disolvente orgánico desnaturalizaría la proteína. En cambio, la proteína se solubiliza con un detergente y se agrega a la solución acuosa después de que se forma la bicapa. El recubrimiento de detergente permite que estas proteínas se inserten espontáneamente en la bicapa durante un período de minutos. Además, se han realizado experimentos iniciales que combinan investigaciones electrofisiológicas y estructurales de membranas lipídicas negras. [5] En otra variación de la técnica BLM, denominada punzón de bicapa, se utiliza una pipeta de vidrio (diámetro interno ~10-40 μm) como electrodo en un lado de la bicapa para aislar un pequeño parche de membrana. [6] [7] Esta modificación de la técnica de fijación de parche permite una grabación de bajo ruido, incluso a potenciales altos (hasta 600 mV), a expensas de un tiempo de preparación adicional.
Los principales problemas asociados con las bicapas pintadas son el disolvente residual y la vida útil limitada. Algunos investigadores creen que las bolsas de disolvente atrapadas entre las dos láminas de la bicapa pueden alterar la función normal de la proteína. Para superar esta limitación, Montal y Mueller desarrollaron una técnica de deposición modificada que elimina el uso de un disolvente pesado no volátil. En este método, la abertura comienza por encima de la superficie del agua, separando completamente las dos cámaras de fluido. En la superficie de cada cámara, se forma una monocapa aplicando lípidos en un disolvente volátil como el cloroformo y esperando a que el disolvente se evapore. Luego, la abertura se baja a través de la interfaz aire-agua y las dos monocapas de las cámaras separadas se pliegan una contra la otra, formando una bicapa a través de la abertura. [8] El problema de la estabilidad ha demostrado ser más difícil de resolver. Normalmente, una membrana lipídica negra sobrevivirá menos de una hora, lo que impide los experimentos a largo plazo . Esta vida útil se puede extender estructurando con precisión la abertura de soporte, [9] reticulando químicamente los lípidos o gelificando la solución circundante para soportar mecánicamente la bicapa. [10] Se está trabajando en este ámbito y será posible alcanzar una vida útil de varias horas.
A diferencia de una vesícula o una membrana celular en la que la bicapa lipídica se enrolla en una cubierta cerrada, una bicapa soportada es una estructura plana que se asienta sobre un soporte sólido. Debido a esto, solo la cara superior de la bicapa está expuesta a la solución libre. Esta disposición tiene ventajas y desventajas relacionadas con el estudio de las bicapas lipídicas. Una de las mayores ventajas de la bicapa soportada es su estabilidad. Las SLB permanecerán prácticamente intactas incluso cuando se sometan a altas velocidades de flujo o vibración y, a diferencia de las membranas lipídicas negras, la presencia de agujeros no destruirá toda la bicapa. Debido a esta estabilidad, los experimentos que duran semanas e incluso meses son posibles con bicapas soportadas, mientras que los experimentos BLM suelen limitarse a horas. [11] Otra ventaja de la bicapa soportada es que, debido a que está sobre una superficie dura plana, es susceptible a una serie de herramientas de caracterización que serían imposibles o ofrecerían una resolución menor si se realizaran en una muestra que flota libremente.
Uno de los ejemplos más claros de esta ventaja es el uso de técnicas de sondeo mecánico que requieren una interacción física directa con la muestra. La microscopía de fuerza atómica (AFM) se ha utilizado para obtener imágenes de la separación de fases lipídicas , [12] la formación de nanoporos transmembrana seguida de la adsorción de moléculas de proteína individuales, [13] y el ensamblaje de proteínas [14] con precisión sub-nm sin la necesidad de un tinte de marcado. Más recientemente, la AFM también se ha utilizado para sondear directamente las propiedades mecánicas de bicapas individuales [15] y para realizar espectroscopia de fuerza en proteínas de membrana individuales. [16] Estos estudios serían difíciles o imposibles sin el uso de bicapas soportadas ya que la superficie de una célula o vesícula es relativamente blanda y se desplazaría y fluctuaría con el tiempo. Otro ejemplo de una sonda física es el uso de la microbalanza de cristal de cuarzo (QCM) para estudiar la cinética de unión en la superficie de la bicapa. [17] La interferometría de polarización dual es una herramienta óptica de alta resolución para caracterizar el orden y la disrupción en las bicapas lipídicas durante las interacciones o transiciones de fase , proporcionando datos complementarios a las mediciones de QCM. [18]
Muchas técnicas modernas de microscopía de fluorescencia también requieren una superficie plana con un soporte rígido. Los métodos de campo evanescente, como la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) y la resonancia de plasmón superficial (SPR), pueden ofrecer una medición extremadamente sensible de la unión del analito y de las propiedades ópticas de la bicapa, pero solo pueden funcionar cuando la muestra está soportada sobre materiales ópticamente funcionales especializados. Otra clase de métodos aplicables solo a bicapas soportadas son los basados en interferencia óptica, como la microscopía de contraste de interferencia de fluorescencia (FLIC), la microscopía de contraste de interferencia de reflexión (RICM) o la microscopía de dispersión interferométrica (iSCAT). [19] [20] Cuando la bicapa está soportada sobre una superficie reflectante, las variaciones de intensidad debidas a la interferencia destructiva de esta interfaz se pueden utilizar para calcular con precisión de angstrom la posición de los fluoróforos dentro de la bicapa. [21] Tanto las técnicas evanescentes como las de interferencia ofrecen una resolución de sublongitud de onda en solo una dimensión (z o vertical). En muchos casos, esta resolución es todo lo que se necesita. Después de todo, las bicapas son muy pequeñas sólo en una dimensión. Lateralmente, una bicapa puede extenderse por muchos micrómetros o incluso milímetros. Pero ciertos fenómenos como la reorganización dinámica de fases ocurren en bicapas en una escala de longitud submicrométrica lateral. Un enfoque prometedor para estudiar estas estructuras es la microscopía óptica de barrido de campo cercano (NSOM). [22] Al igual que la AFM, la NSOM se basa en el escaneo de una punta micromaquinada para dar una señal altamente localizada. Pero a diferencia de la AFM, la NSOM utiliza una interacción óptica en lugar de física con la muestra, lo que potencialmente perturba las estructuras delicadas en menor medida.
Otra capacidad importante de las bicapas soportadas es la capacidad de modelar la superficie para producir múltiples regiones aisladas en el mismo sustrato. Este fenómeno se demostró por primera vez utilizando raspaduras o “corrales” metálicos para evitar la mezcla entre regiones adyacentes y, al mismo tiempo, permitir la libre difusión dentro de cualquier región. [23] [24] Trabajos posteriores ampliaron este concepto mediante la integración de microfluídica para demostrar que se podían formar gradientes de composición estables en bicapas, [25] lo que potencialmente permitiría estudios masivamente paralelos de segregación de fases, unión molecular y respuesta celular a membranas lipídicas artificiales. La utilización creativa del concepto de corral también ha permitido estudios de la reorganización dinámica de proteínas de membrana en la interfaz sináptica . [26]
Una de las principales limitaciones de las bicapas soportadas es la posibilidad de interacciones no deseadas con el sustrato. Aunque las bicapas soportadas generalmente no tocan directamente la superficie del sustrato, están separadas solo por un espacio de agua muy fino. El tamaño y la naturaleza de este espacio dependen del material del sustrato [27] y de las especies de lípidos, pero generalmente es de alrededor de 1 nm para lípidos zwitteriónicos soportados en sílice , el sistema experimental más común. [28] [29] Debido a que esta capa es tan delgada, existe un amplio acoplamiento hidrodinámico entre la bicapa y el sustrato, lo que resulta en un coeficiente de difusión menor en bicapas soportadas que para bicapas libres de la misma composición. [30] Un cierto porcentaje de la bicapa soportada también será completamente inmóvil, aunque la naturaleza exacta y la razón de estos sitios "fijados" aún son inciertas. Para bicapas soportadas en fase líquida de alta calidad, la fracción inmóvil suele ser de alrededor del 1-5%. Para cuantificar el coeficiente de difusión y la fracción móvil, los investigadores que estudian bicapas soportadas a menudo informarán datos FRAP .
Las interacciones no deseadas con el sustrato son un problema mucho mayor cuando se incorporan proteínas de membrana integrales, en particular aquellas con grandes dominios que sobresalen más allá del núcleo de la bicapa. Debido a que el espacio entre la bicapa y el sustrato es tan delgado, estas proteínas a menudo se desnaturalizan en la superficie del sustrato y, por lo tanto, pierden toda funcionalidad. [31] Un enfoque para evitar este problema es el uso de bicapas unidas a polímeros. En estos sistemas, la bicapa se apoya en una red suelta de polímeros hidratados o hidrogel que actúa como espaciador y, en teoría, evita las interacciones desnaturalizantes con el sustrato. [32] En la práctica, un cierto porcentaje de las proteínas seguirá perdiendo movilidad y funcionalidad, probablemente debido a las interacciones con los anclajes de polímero/lípido. [30] La investigación en esta área está en curso.
El uso de una membrana lipídica bicapa anclada (t-BLM) aumenta aún más la estabilidad de las membranas soportadas al anclar químicamente los lípidos al sustrato sólido. [33]
El oro puede utilizarse como sustrato debido a su química inerte y a los tiolípidos para la unión covalente con el oro. Los tiolípidos están compuestos de derivados lipídicos, extendidos en sus grupos de cabeza polares por espaciadores hidrófilos que terminan en un grupo tiol o disulfuro que forma un enlace covalente con el oro, formando monocapas autoensambladas (SAM).
La limitación de la movilidad intramembrana de las bicapas lipídicas soportadas se puede superar introduciendo lípidos de anclaje que atraviesan la mitad de la membrana [34] con disulfuro de bencilo (DPL) y lípidos sintéticos que atraviesan la membrana completa análogos de arqueas con cadenas de fitanólido para estabilizar la estructura y unidades de polietilenglicol como espaciador hidrófilo. La formación de la bicapa se logra mediante la exposición del sustrato de oro recubierto de lípidos a los lípidos de la capa externa, ya sea en una solución de etanol o en liposomas. [35]
La ventaja de este enfoque es que, debido al espacio hidrófilo de alrededor de 4 nm, la interacción con el sustrato es mínima y el espacio adicional permite la introducción de canales iónicos proteicos en la bicapa. Además, la capa espaciadora crea un reservorio iónico [36] que permite medir fácilmente la impedancia eléctrica de CA a través de la bicapa.
Una vesícula es una bicapa lipídica enrollada en una envoltura esférica que encierra una pequeña cantidad de agua y la separa del agua que se encuentra fuera de la vesícula. Debido a esta similitud fundamental con la membrana celular, las vesículas se han utilizado ampliamente para estudiar las propiedades de las bicapas lipídicas. Otra razón por la que las vesículas se han utilizado con tanta frecuencia es que son relativamente fáciles de fabricar. Si una muestra de lípido deshidratado se expone al agua, formará vesículas espontáneamente. [37] Estas vesículas iniciales suelen ser multilamelares (de muchas paredes) y tienen un amplio rango de tamaños, desde decenas de nanómetros hasta varios micrómetros. [38] Se necesitan métodos como la sonicación o la extrusión a través de una membrana para romper estas vesículas iniciales en vesículas más pequeñas, de una sola pared y de diámetro uniforme, conocidas como vesículas unilamelares pequeñas (SUV). Las SUV suelen tener diámetros de entre 50 y 200 nm. [39] Alternativamente, en lugar de sintetizar vesículas, es posible simplemente aislarlas de cultivos celulares o muestras de tejido. [40] Las vesículas se utilizan para transportar lípidos, proteínas y muchas otras moléculas dentro de la célula, así como hacia adentro o hacia afuera de la célula. Estas vesículas aisladas naturalmente están compuestas de una mezcla compleja de diferentes lípidos y proteínas, por lo que, aunque ofrecen un mayor realismo para estudiar fenómenos biológicos específicos, se prefieren las vesículas artificiales simples para estudios de propiedades lipídicas fundamentales.
Dado que los SUV artificiales se pueden fabricar en grandes cantidades, son adecuados para estudios de materiales a granel, como la difracción de rayos X para determinar el espaciado reticular [41] y la calorimetría diferencial de barrido para determinar las transiciones de fase. [42] La interferometría de polarización dual puede medir estructuras unilamelares y multilamelares y la inserción y disrupción de las vesículas en un formato de ensayo sin etiqueta. [43] Las vesículas también se pueden etiquetar con colorantes fluorescentes para permitir ensayos de fusión sensibles basados en FRET . [44]
A pesar del marcado fluorescente, a menudo es difícil realizar imágenes detalladas en SUVs simplemente porque son muy pequeñas. Para combatir este problema, los investigadores utilizan vesículas unilamelares gigantes (GUV). Las GUV son lo suficientemente grandes (1 - 200 μm) para ser estudiadas utilizando microscopía de fluorescencia tradicional y están dentro del mismo rango de tamaño que la mayoría de las células biológicas. Por lo tanto, se utilizan como imitaciones de membranas celulares para estudios in vitro en biología molecular y celular. Muchos de los estudios de balsas lipídicas en sistemas lipídicos artificiales se han realizado con GUV por esta razón. [45] En comparación con las bicapas soportadas, las GUV presentan un entorno más "natural" ya que no hay una superficie rígida que pueda inducir defectos, afectar las propiedades de la membrana o desnaturalizar las proteínas. Por lo tanto, las GUV se utilizan con frecuencia para estudiar la remodelación de la membrana y otras interacciones proteína-membrana in vitro. Existe una variedad de métodos para encapsular proteínas u otros reactivos biológicos dentro de dichas vesículas, lo que hace que las GUV sean un sistema ideal para la recreación in vitro (e investigación) de funciones celulares en entornos de membrana modelo similares a células. [46] Estos métodos incluyen métodos microfluídicos, que permiten una producción de alto rendimiento de vesículas con tamaños consistentes. [47]
Las bicapas de interfaz de gotitas (DIB) son gotitas envueltas en fosfolípidos que forman bicapas cuando se ponen en contacto. [48] [49] Las gotitas están rodeadas de aceite y los fosfolípidos se dispersan en el agua o en el aceite. [48] Como resultado, los fosfolípidos forman espontáneamente una monocapa en cada una de las interfaces aceite-agua. [48] Las DIB se pueden formar para crear material similar al tejido con la capacidad de formar bicapas asimétricas, reconstituir proteínas y canales de proteínas o fabricarse para su uso en el estudio de la electrofisiología. [50] [51] [52] [53] [54] Las redes DIB extendidas se pueden formar empleando dispositivos microfluídicos de gotitas o utilizando impresoras de gotitas. [54] [55]
Las micelas de detergente [56] son otra clase de membranas modelo que se utilizan comúnmente para purificar y estudiar proteínas de membrana , aunque carecen de una bicapa lipídica. En soluciones acuosas, las micelas son conjuntos de moléculas anfipáticas con sus cabezas hidrófilas expuestas al solvente y sus colas hidrófobas en el centro. Las micelas pueden solubilizar proteínas de membrana encapsulándolas parcialmente y protegiendo sus superficies hidrófobas del solvente.
Las bicelas son una clase relacionada de membrana modelo, [57] típicamente formadas por dos lípidos, uno de los cuales forma una bicapa lipídica mientras que el otro forma un ensamblaje anfipático, similar a una micela, que protege el centro de la bicapa de las moléculas de solvente circundantes. Las bicelas pueden considerarse como un segmento de bicapa encapsulado y solubilizado por una micela. Las bicelas son mucho más pequeñas que los liposomas, por lo que pueden usarse en experimentos como la espectroscopia de RMN donde las vesículas más grandes no son una opción.
Los nanodiscos [58] consisten en un segmento de bicapa encapsulado por una capa de proteína anfipática, en lugar de una capa lipídica o de detergente. Los nanodiscos son más estables que las bicelas y micelas a bajas concentraciones, y tienen un tamaño muy bien definido (dependiendo del tipo de capa de proteína, entre 10 y 20 nm ). Las proteínas de membrana incorporadas y solubilizadas por los nanodiscos pueden estudiarse mediante una amplia variedad de técnicas biofísicas. [59] [60]