Métodos optogenéticos para registrar la actividad celular.
La optogenética comenzó con métodos para alterar la actividad neuronal con luz, utilizando, por ejemplo, canalrodopsinas . En un sentido más amplio, los enfoques optogenéticos también incluyen el uso de biosensores codificados genéticamente para monitorear la actividad de las neuronas u otros tipos de células midiendo la fluorescencia o la bioluminiscencia . Los indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI) se utilizan con frecuencia para controlar la actividad neuronal, pero también se pueden registrar ópticamente otros parámetros celulares como el voltaje de la membrana o la actividad del segundo mensajero. El uso de sensores optogenéticos no se limita a la neurociencia , sino que desempeña un papel cada vez más importante en la inmunología , la cardiología y la investigación del cáncer .
Historia
Los primeros experimentos para medir los niveles de calcio intracelular mediante la expresión de proteínas se basaron en la aequorina , una proteína bioluminiscente de la medusa Aequorea . Sin embargo, para producir luz, esta enzima necesita el compuesto "combustible" coelenteracina , que debe añadirse al preparado. Esto no es práctico en animales intactos y, además, la resolución temporal de las imágenes de bioluminiscencia es relativamente pobre (segundos-minutos). El primer indicador de calcio fluorescente codificado genéticamente (GECI) que se utilizó para obtener imágenes de la actividad en un animal fue el cameleon , diseñado por Atsushi Miyawaki, Roger Tsien y sus compañeros de trabajo en 1997. [1] Cameleon fue utilizado con éxito por primera vez en un animal por Rex Kerr, William Schafer y compañeros de trabajo para registrar neuronas y células musculares del nematodo C. elegans . [2] Posteriormente, Cameleon se utilizó para registrar la actividad neuronal en moscas [3] y peces cebra. [4] En mamíferos, el primer GECI que se utilizó in vivo fue GCaMP , [5] desarrollado por primera vez por Junichi Nakai y sus compañeros de trabajo en 2001. [6] GCaMP ha experimentado numerosas mejoras, en particular por parte de un equipo de científicos de Janelia Farm Research. Campus (proyecto GENIE, HHMI ) y GCaMP6 [7] en particular se han utilizado ampliamente en neurociencia. Muy recientemente, se han aprovechado los receptores acoplados a la proteína G para generar una serie de indicadores altamente específicos para diversos neurotransmisores . [8] [9]
Criterios de diseño
Los sensores codificados genéticamente son proteínas de fusión , que constan de un dominio de unión a ligando (sensor) y una proteína fluorescente , unidas por un conector corto (péptido flexible). Cuando el dominio sensor se une al ligando correcto, cambia de conformación. Este movimiento se transfiere a la proteína fluorescente y la deformación resultante provoca un cambio en la fluorescencia. La eficiencia de este proceso depende críticamente de la longitud de la región del conector, que debe optimizarse en un proceso que requiere mucha mano de obra. La proteína fluorescente a menudo se permuta circularmente, es decir, se crearon nuevos extremos C-terminal y N-terminal . Los sensores de longitud de onda única son fáciles de usar para mediciones cualitativas, pero difíciles de calibrar para mediciones cuantitativas de concentración de ligando.
Una segunda clase de sensores se basa en la transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) entre dos proteínas fluorescentes (FP) de diferente color. El FP (donante) de longitud de onda más corta se excita con luz azul de un láser o LED. Si el segundo FP (aceptor) está muy cerca, la energía se transfiere al aceptor, lo que produce una fluorescencia amarilla o roja. Cuando el FP aceptor se aleja, el donante emite fluorescencia verde. El dominio sensor normalmente se empalma entre los dos FP, lo que resulta en un movimiento de tipo bisagra tras la unión del ligando que cambia la distancia entre el donante y el aceptor. El procedimiento de obtención de imágenes es más complejo para los sensores FRET, pero la relación de fluorescencia se puede calibrar para medir la concentración absoluta de un ligando. También es posible la lectura mediante imágenes de vida útil de la fluorescencia (FLIM) de la fluorescencia del donante, ya que el proceso FRET acelera la disminución de la fluorescencia.
Ventajas de los sensores optogenéticos
Puede dirigirse a clases específicas de células (por ejemplo, astrocitos o células piramidales ). Esto permite una lectura óptica sin resolución espacial, por ejemplo, fotometría de fibra de áreas profundas del cerebro. [10]
puede dirigirse a compartimentos subcelulares (p. ej., sinapsis, orgánulos , núcleo) fusionando la proteína indicadora con dominios de anclaje específicos, señales de retención o intracuerpos .
Algunos sensores basados en GPCR son sensibles a la polarización [12]
la mayoría de los indicadores son fluorescentes de color verde, lo que dificulta la medición de varios parámetros celulares simultáneamente ( multiplexación ).
Clases de indicadores codificados genéticamente.
El indicador de calcio GCaMP en su forma unida a calcio (arriba) y sin calcio (abajo). Cuando Ca- calmodulina (cian) se une a M13, la conformación cambia y el cilindro de cpGFP se cierra, lo que permite la fluorescencia verde.
Se han diseñado indicadores para medir concentraciones de iones, potencial de membrana, neurotransmisores y diversas moléculas de señalización intracelular. La siguiente lista proporciona sólo ejemplos para cada clase; Se han publicado muchos más.
señalización intracelular
Indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI): una gran clase de herramientas basadas en proteínas naturales fijadoras de calcio ( calmodulina , troponina ). Diferentes afinidades, cinéticas y colores (verde, rojo) disponibles. Lectura mediante intensidad de fluorescencia (indicadores de longitud de onda única), FRET o BRET . Se han dirigido a diversos orgánulos. Versión actual: JGCaMP8 [13]
Indicadores de cloruro genéticamente codificados : Clomeleon [14]
Indicadores de potasio genéticamente codificados : GINKO2 [15]
Indicadores genéticamente codificados para el pH intracelular (GEPhI): CypHer [16]
Sensor genéticamente codificado para lactato : eLACCO1.1 [33]
Otras lecturas
Una revisión reciente de indicadores fluorescentes codificados genéticamente basados en GPCR para neuromoduladores [9]
enlaces externos
Base de datos de biosensores fluorescentes, una lista de búsqueda bastante completa de sensores publicados y sus propiedades básicas, mantenida por el laboratorio de Jin Zhang en UCSD. [34]
Biosensores fluorescentes disponibles en Addgene , un depósito de plásmidos sin fines de lucro.
Referencias
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