La luciferasa de luciérnaga es la enzima emisora de luz responsable de la bioluminiscencia de las luciérnagas y los escarabajos chasqueadores . La enzima cataliza la oxidación de la luciferina de la luciérnaga , que requiere oxígeno y ATP . Debido al requerimiento de ATP, las luciferasas de luciérnaga se han utilizado ampliamente en biotecnología.
La reacción química catalizada por la luciferasa de luciérnaga se lleva a cabo en dos pasos:
La luz se produce porque la reacción forma oxiluciferina en un estado excitado electrónicamente . La reacción libera un fotón de luz a medida que la oxiluciferina vuelve al estado fundamental .
El adenilato de luciferilo puede participar además en una reacción secundaria con O2 para formar peróxido de hidrógeno y deshidroluciferil-AMP. Alrededor del 20 % del intermediario adenilato de luciferilo se oxida en esta vía. [1]
La luciferasa de luciérnaga genera luz a partir de la luciferina en un proceso de varios pasos. Primero, la D-luciferina es adenilada por MgATP para formar adenilato de luciferilo y pirofosfato. Después de la activación por ATP, el adenilato de luciferilo es oxidado por oxígeno molecular para formar un anillo de dioxetanona. Una reacción de descarboxilación forma un estado excitado de oxiluciferina, que se tautomeriza entre la forma ceto-enol. La reacción finalmente emite luz a medida que la oxiluciferina regresa al estado fundamental. [2]
La luciferasa puede funcionar en dos vías diferentes: una vía de bioluminiscencia y una vía de CoA -ligasa. [4] En ambas vías, la luciferasa cataliza inicialmente una reacción de adenilación con MgATP. Sin embargo, en la vía de CoA-ligasa, la CoA puede desplazar al AMP para formar luciferil CoA.
De manera similar, la acil-CoA sintetasa activa los ácidos grasos con ATP, seguido del desplazamiento del AMP con CoA. Debido a sus actividades similares, la luciferasa es capaz de reemplazar a la acil-CoA sintetasa y convertir los ácidos grasos de cadena larga en acil-CoA graso para la betaoxidación . [4]
La estructura proteica de la luciferasa de luciérnaga consta de 550 aminoácidos en dos dominios compactos : el dominio N-terminal y el dominio C-terminal . El dominio N-terminal está compuesto por dos láminas β en una estructura αβαβα y un barril β . Las dos láminas β se apilan una sobre la otra, con el barril β cubriendo el extremo de las láminas. [2]
El dominio C-terminal está conectado al dominio N-terminal mediante una bisagra flexible, que puede separar los dos dominios. Las secuencias de aminoácidos en la superficie de los dos dominios enfrentados se conservan en la luciferasa bacteriana y de luciérnaga, lo que sugiere firmemente que el sitio activo se encuentra en la hendidura entre los dominios. [5]
Durante una reacción, la luciferasa sufre un cambio conformacional y pasa a una forma "cerrada" en la que los dos dominios se unen para encerrar el sustrato. Esto garantiza que el agua quede excluida de la reacción y no hidrolice el ATP ni el producto excitado electrónicamente. [5]
El color de la bioluminiscencia de la luciferasa de luciérnaga puede variar entre amarillo verdoso (λ max = 550 nm) a rojo (λ max = 620). [6] Actualmente existen varios mecanismos diferentes que describen cómo la estructura de la luciferasa afecta el espectro de emisión del fotón y, efectivamente, el color de la luz emitida.
Un mecanismo propone que el color de la luz emitida depende de si el producto está en forma ceto o enólica . El mecanismo sugiere que la luz roja se emite desde la forma cetogénica de la oxiluciferina, mientras que la luz verde se emite desde la forma enólica de la oxiluciferina. [7] [8] Sin embargo, la 5,5-dimetiloxiluciferina emite luz verde a pesar de que está restringida a la forma cetogénica porque no puede tautomerizarse. [9]
Otro mecanismo propone que la torsión del ángulo entre los anillos de benzotiazol y tiazol en la oxiluciferina determina el color de la bioluminiscencia. Esta explicación propone que una forma plana con un ángulo de 0° entre los dos anillos corresponde a un estado de mayor energía y emite una luz verde de mayor energía, mientras que un ángulo de 90° coloca la estructura en un estado de menor energía y emite una luz roja de menor energía. [10]
La explicación más reciente para el color de la bioluminiscencia examina el microambiente de la oxiluciferina excitada. Los estudios sugieren que las interacciones entre el producto del estado excitado y los residuos cercanos pueden forzar a la oxiluciferina a una forma de energía aún más alta, lo que da como resultado la emisión de luz verde. Por ejemplo, Arg 218 tiene interacciones electrostáticas con otros residuos cercanos, lo que restringe la oxiluciferina de tautomerizarse a la forma enólica. [11] De manera similar, otros resultados han indicado que el microambiente de la luciferasa puede forzar a la oxiluciferina a una estructura más rígida y de alta energía, lo que la obliga a emitir una luz verde de alta energía. [12]
La D-luciferina es el sustrato de la reacción de bioluminiscencia de la luciferasa de la luciérnaga, mientras que la L-luciferina es el sustrato de la actividad de la luciferil-CoA sintetasa. Ambas reacciones son inhibidas por el enantiómero del sustrato: la L-luciferina y la D-luciferina inhiben la vía de la bioluminiscencia y la vía de la CoA-ligasa, respectivamente. [3] Esto demuestra que la luciferasa puede diferenciar entre los isómeros de la estructura de la luciferina.
La L-luciferina puede emitir una luz débil a pesar de ser un inhibidor competitivo de la D-luciferina y de la vía de bioluminiscencia. [13] La luz se emite porque la vía de síntesis de CoA se puede convertir en la reacción de bioluminiscencia hidrolizando el producto final a través de una esterasa para volver a D-luciferina. [3]
La actividad de la luciferasa es inhibida adicionalmente por la oxiluciferina [14] y activada alostéricamente por el ATP. Cuando el ATP se une a los dos sitios alostéricos de la enzima, la afinidad de la luciferasa para unirse al ATP en su sitio activo aumenta. [6]
Se cree que la luciferasa de luciérnaga es un homólogo de la acil-CoA sintetasa de cadena larga debido a su capacidad para sintetizar luciferil-CoA a partir de CoA y deshidroluciferil-AMP. Inouye probó esta hipótesis en 2010 expresando el ADNc de las luciferasas de Photinus pyralis y Lychocoriolaus lateralis en E. coli a través de la expresión génica de choque frío. [15] Las enzimas resultantes se expusieron luego a ácidos grasos de cadena larga, ácidos grasos de cadena corta, aminoácidos e iminoácidos. Como era de esperar, Inouye descubrió que las luciferasas solo mostraban actividad de adenilación cuando se exponían a ácidos grasos de cadena larga.
También se descubrió que el producto génico de CG6178 en Drosophila tenía una gran similitud de secuencia de aminoácidos con la luciferasa de luciérnaga. Si bien mostró una alta actividad de adenilación cuando se expuso a ácidos grasos de cadena larga, no hubo luminiscencia cuando se expuso al oxígeno y LH 2 -AMP–, lo que sugiere además que la luciferasa surgió como un homólogo de acil graso-CoA de cadena larga debido a la duplicación génica.
Los análisis filogenéticos realizados por Zhang et al . (2020) sugieren que las luciferasas de las familias Lampyridae , Rhagopthalmidae y Phenogodidae divergieron de la familia Elateridae hace 205 millones de años. [16] Según los datos filogenéticos, las emergencias de estas dos luciferasas aparecieron incluso antes de que las familias pudieran divergir, lo que indica su naturaleza análoga debido a convergencias fenotípicas.