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Ratón knockout

Un ratón knockout , o ratón knock-out , es un ratón genéticamente modificado ( Mus musculus ) en el que los investigadores han inactivado o " eliminado " un gen existente reemplazándolo o alterándolo con un fragmento artificial de ADN . Son importantes modelos animales para estudiar el papel de genes que han sido secuenciados pero cuyas funciones no han sido determinadas. Al hacer que un gen específico esté inactivo en el ratón y observar cualquier diferencia con respecto al comportamiento o la fisiología normal, los investigadores pueden inferir su probable función.

Los ratones son actualmente las especies de animales de laboratorio más estrechamente relacionadas con los humanos a las que se puede aplicar fácilmente la técnica de eliminación. Se utilizan ampliamente en experimentos knockout, especialmente aquellos que investigan cuestiones genéticas relacionadas con la fisiología humana . La desactivación genética en ratas es mucho más difícil y sólo ha sido posible desde 2003. [1] [2]

El primer ratón knockout registrado fue creado por Mario R. Capecchi , Martin Evans y Oliver Smithies en 1989, por lo que recibieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 2007 . Algunos aspectos de la tecnología para generar ratones knockout y los propios ratones han sido patentados en muchos países por empresas privadas.

Usar

Un ratón de laboratorio en el que se ha eliminado un gen que afecta el crecimiento del cabello (izquierda) se muestra junto a un ratón de laboratorio normal.

Eliminar la actividad de un gen proporciona información sobre lo que ese gen hace normalmente. Los humanos comparten muchos genes con los ratones. En consecuencia, observar las características de los ratones knockout brinda a los investigadores información que puede usarse para comprender mejor cómo un gen similar puede causar o contribuir a enfermedades en humanos.

Ejemplos de investigaciones en las que los ratones knockout han sido útiles incluyen el estudio y modelado de diferentes tipos de cáncer , obesidad , enfermedades cardíacas , diabetes , artritis , abuso de sustancias , ansiedad , envejecimiento y enfermedad de Parkinson . Los ratones knockout también ofrecen un contexto biológico y científico en el que se pueden desarrollar y probar fármacos y otras terapias.

Cada año se utilizan millones de ratones knockout en experimentos. [3]

Presiones

Un ratón knockout (izquierda) que es un modelo de obesidad, en comparación con un ratón normal

Hay varios miles de cepas diferentes de ratones knockout. [3] Muchos modelos de ratón llevan el nombre del gen que ha sido inactivado. Por ejemplo, el ratón knockout para p53 lleva el nombre del gen p53 que codifica una proteína que normalmente suprime el crecimiento de tumores al detener la división celular y/o inducir la apoptosis. Los humanos que nacen con mutaciones que desactivan el gen p53 tienen el síndrome de Li-Fraumeni , una condición que aumenta dramáticamente el riesgo de desarrollar cánceres de huesos, cáncer de mama y cánceres de sangre a una edad temprana. Otros modelos de ratones reciben nombres según sus características físicas o comportamientos.

Procedimiento

El procedimiento para producir blastocistos de genotipo mixto.
Esquema de reproducción para producir ratones knockout. Se inyectan blastocistos que contienen células, que son tanto de tipo salvaje como knockout, en el útero de una madre adoptiva. Esto produce descendencia que es de tipo salvaje y tiene el mismo color que el donante de blastocisto (gris) o quimera (mixta) y está parcialmente eliminada. Los ratones quimera se cruzan con un ratón de tipo salvaje normal (gris). Esto produce descendencia que es blanca y heterocigótica para el gen desactivado o gris y de tipo salvaje. Posteriormente, se pueden cruzar ratones heterocigotos blancos para producir ratones que sean homocigotos para el gen desactivado.

Existen varias variaciones del procedimiento de producción de ratones knockout; el siguiente es un ejemplo típico.

  1. El gen que se va a eliminar se aísla de una biblioteca de genes de ratón . Luego se diseña una nueva secuencia de ADN que es muy similar al gen original y a su secuencia vecina inmediata, excepto que se cambia lo suficiente como para hacer que el gen sea inoperable. Normalmente, a la nueva secuencia también se le asigna un gen marcador , un gen que los ratones normales no tienen y que confiere resistencia a un determinado agente tóxico (p. ej., neomicina) o que produce un cambio observable (p. ej., color o fluorescencia). Además, también se incluye en la construcción un segundo gen, tal como herpes tk+, para lograr una selección completa.
  2. Las células madre embrionarias se aíslan de un blastocisto de ratón (un embrión muy joven ) y se cultivan in vitro . Para este ejemplo, tomaremos células madre de un ratón blanco.
  3. La nueva secuencia del paso 1 se introduce en las células madre del paso 2 mediante electroporación . Mediante el proceso natural de recombinación homóloga, algunas de las células madre electroporadas incorporarán la nueva secuencia con el gen eliminado en sus cromosomas en lugar del gen original. Las posibilidades de que se produzca una recombinación exitosa son relativamente bajas, por lo que la mayoría de las células alteradas tendrán la nueva secuencia solo en uno de los dos cromosomas relevantes; se dice que son heterocigotas . Las células que se transformaron con un vector que contiene el gen de resistencia a la neomicina y el gen del herpes tk+ se cultivan en una solución que contiene neomicina y ganciclovir para seleccionar las transformaciones que ocurrieron mediante recombinación homóloga. Cualquier inserción de ADN que se haya producido mediante inserción aleatoria morirá porque da positivo tanto para el gen de resistencia a la neomicina como para el gen del herpes tk+, cuyo producto genético reacciona con el ganciclovir para producir una toxina mortal. Además, las células que no integran nada del material genético dan negativo en ambos genes y, por tanto, mueren como consecuencia del envenenamiento con neomicina.
  4. Las células madre embrionarias que incorporaron el gen desactivado se aíslan de las células inalteradas utilizando el gen marcador del paso 1. Por ejemplo, las células inalteradas se pueden destruir utilizando un agente tóxico al que las células alteradas sean resistentes.
  5. Las células madre embrionarias eliminadas del paso 4 se insertan en un blastocisto de ratón . Para este ejemplo, utilizamos blastocistos de un ratón gris. Los blastocistos ahora contienen dos tipos de células madre: las originales (del ratón gris) y las células eliminadas (del ratón blanco). Estos blastocistos luego se implantan en el útero de ratones hembra, donde se desarrollan. Los ratones recién nacidos serán, por tanto, quimeras : algunas partes de sus cuerpos resultan de las células madre originales, otras partes de las células madre eliminadas. Su pelaje mostrará manchas blancas y grises, con manchas blancas derivadas de las células madre eliminadas y manchas grises del blastocisto receptor.
  6. Algunos de los ratones quimera recién nacidos tendrán gónadas derivadas de células madre desactivadas y, por lo tanto, producirán óvulos o espermatozoides que contienen el gen desactivado. Cuando estos ratones quimera se cruzan con otros de tipo salvaje, algunos de sus descendientes tendrán una copia del gen desactivado en todas sus células. Estos ratones no conservan ningún ADN de ratón gris y no son quimeras, aunque siguen siendo heterocigotos.
  7. Cuando estos descendientes heterocigotos se cruzan, algunos de ellos heredarán el gen desactivado de ambos padres; no portan ninguna copia funcional del gen original inalterado (es decir, son homocigotos para ese alelo).

Una explicación detallada de cómo se crean los ratones knockout (KO) se encuentra en el sitio web del Premio Nobel de Fisiología o Medicina 2007. [4]

Limitaciones

Los Institutos Nacionales de Salud analizan algunas limitaciones importantes de esta técnica. [5]

Si bien la tecnología del ratón knockout representa una valiosa herramienta de investigación, existen algunas limitaciones importantes. Alrededor del 15 por ciento de los genes knockout son letales para el desarrollo, lo que significa que los embriones genéticamente alterados no pueden convertirse en ratones adultos. Este problema a menudo se supera mediante el uso de mutaciones condicionales . La falta de ratones adultos limita los estudios al desarrollo embrionario y, a menudo, dificulta la determinación de la función de un gen en relación con la salud humana . En algunos casos, el gen puede cumplir una función diferente en adultos que en embriones en desarrollo.

La eliminación de un gen también puede no producir un cambio observable en un ratón o incluso puede producir características diferentes de las observadas en humanos en los que el mismo gen está inactivado. Por ejemplo, las mutaciones en el gen p53 están asociadas con más de la mitad de los cánceres humanos y a menudo conducen a tumores en un conjunto particular de tejidos. Sin embargo, cuando el gen p53 es desactivado en ratones, los animales desarrollan tumores en una variedad diferente de tejidos.

Existe una variabilidad en todo el procedimiento que depende en gran medida de la cepa de la que se derivan las células madre. Generalmente se utilizan células derivadas de la cepa 129. Esta cepa específica no es adecuada para muchos experimentos (por ejemplo, conductuales), por lo que es muy común retrocruzar la descendencia con otras cepas. Se ha demostrado que algunos loci genómicos son muy difíciles de eliminar. Las razones podrían ser la presencia de secuencias repetitivas, una metilación extensa del ADN o heterocromatina . La confusa presencia de 129 genes vecinos en el segmento knockout del material genético se ha denominado "efecto del gen flanqueante". [6] Se han propuesto métodos y directrices para abordar este problema. [7] [8]

Otra limitación es que los ratones knockout convencionales (es decir, no condicionales) se desarrollan en ausencia del gen que se está investigando. En ocasiones, la pérdida de actividad durante el desarrollo puede enmascarar el papel del gen en el estado adulto, especialmente si el gen participa en numerosos procesos que abarcan el desarrollo. Entonces se requieren enfoques de mutación condicional/inducible que primero permitan que el ratón se desarrolle y madure normalmente antes de la ablación del gen de interés.

Otra limitación grave es la falta de adaptaciones evolutivas en el modelo knockout que podrían ocurrir en animales de tipo salvaje después de que mutan naturalmente. Por ejemplo, la coexpresión específica de eritrocitos de GLUT1 con estomatina constituye un mecanismo compensatorio en mamíferos que no pueden sintetizar vitamina C. [9]

Ver también

Referencias

  1. ^ Pilcher HR (19 de mayo de 2003). "Es un nocaut". Naturaleza . doi : 10.1038/noticias030512-17 . Consultado el 3 de abril de 2014 .
  2. ^ Zan Y, Haag JD, Chen KS, Shepel LA, Wigington D, Wang YR, Hu R, Lopez-Guajardo CC, Brose HL, Porter KI, Leonard RA, Hitt AA, Schommer SL, Elegbede AF, Gould MN (junio de 2003) ). "Producción de ratas knockout mediante mutagénesis ENU y un ensayo de detección basado en levadura". Biotecnología de la Naturaleza . 21 (6): 645–51. doi :10.1038/nbt830. PMID  12754522. S2CID  32611710.
  3. ^ ab Spencer G (diciembre de 2002). "Antecedentes del ratón como organismo modelo". Instituto Nacional de Investigaciones del Genoma Humano . Consultado el 3 de abril de 2014 .
  4. ^ "El Premio Nobel de Fisiología o Medicina 2007". Premio Nobel.org. 1985-09-19 . Consultado el 3 de abril de 2014 .
  5. ^ "Hoja informativa sobre ratones knockout". Instituto Nacional de Investigaciones del Genoma Humano. Agosto de 2015 . Consultado el 3 de abril de 2014 .
  6. ^ Gerlai R (mayo de 1996). "Estudios de orientación genética del comportamiento de los mamíferos: ¿es la mutación o el genotipo de fondo?". Tendencias en Neurociencias . 19 (5): 177–81. doi :10.1016/S0166-2236(96)20020-7. PMID  8723200. S2CID  33396039.
  7. ^ Wolfer DP, Crusio WE , Lipp HP (julio de 2002). "Ratones knockout: soluciones simples a los problemas de fondo genético y genes flanqueantes". Tendencias en Neurociencias . 25 (7): 336–40. doi :10.1016/S0166-2236(02)02192-6. PMID  12079755. S2CID  33777888.
  8. ^ Crusio WE, Goldowitz D, Holmes A, Wolfer D (febrero de 2009). "Estándares para la publicación de estudios de mutantes en ratones". Genes, cerebro y comportamiento . 8 (1): 1–4. doi : 10.1111/j.1601-183X.2008.00438.x . PMID  18778401. S2CID  205853147.
  9. ^ Montel-Hagen A, Kinet S, Manel N, Mongellaz C, Prohaska R, Battini JL, Delaunay J, Sitbon M, Taylor N (March 2008). "Erythrocyte Glut1 triggers dehydroascorbic acid uptake in mammals unable to synthesize vitamin C". Cell. 132 (6): 1039–48. doi:10.1016/j.cell.2008.01.042. PMID 18358815.

External links

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