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Hibridación ADN-ADN

En genómica , la hibridación ADN-ADN es una técnica de biología molecular que mide el grado de similitud genética entre secuencias de ADN . Se utiliza para determinar la distancia genética entre dos organismos y se ha utilizado ampliamente en filogenia y taxonomía . [1]

Método

El ADN de un organismo se marca y luego se mezcla con el ADN no marcado para compararlo. La mezcla se incuba para permitir que las cadenas de ADN se disocian y luego se enfría para formar ADN híbrido de doble cadena renovado. Las secuencias hibridadas con un alto grado de similitud se unirán más firmemente y requerirán más energía para separarlas: es decir, se separan cuando se calientan a una temperatura más alta que las secuencias diferentes, un proceso conocido como " fusión del ADN ". [2] [3] [4]

Para evaluar el perfil de fusión del ADN hibridado, el ADN bicatenario se une a una columna o filtro y la mezcla se calienta en pequeños pasos. En cada paso, se lava la columna o filtro; Las secuencias que se derriten se vuelven monocatenarias y se lavan. Las temperaturas a las que se desprende el ADN marcado reflejan la cantidad de similitud entre secuencias (y la muestra de autohibridación sirve como control). Estos resultados se combinan para determinar el grado de similitud genética entre organismos. [5]

Se introdujo un método para hibridar un gran número de muestras de ADN con un gran número de sondas de ADN en una única membrana. Estas muestras tendrían que separarse en sus propios carriles dentro de las membranas y luego la membrana tendría que rotarse a un ángulo diferente donde se produciría una hibridación simultánea con muchas sondas de ADN diferentes. [6]

Usos

Cuando se comparan varias especies, los valores de similitud permiten ordenar los organismos en un árbol filogenético ; por lo tanto, es un posible enfoque para llevar a cabo la sistemática molecular . [ cita necesaria ]

En microbiología

La hibridación ADN-ADN (DDH) se utiliza como método principal para distinguir especies bacterianas, ya que es difícil clasificarlas visualmente con precisión. [7] Esta técnica no se utiliza ampliamente en organismos más grandes donde las diferencias entre especies son más fáciles de identificar. A finales del siglo XX, se consideraba que las cepas pertenecían a la misma especie si tenían un valor de similitud ADN-ADN superior al 70% y sus temperaturas de fusión estaban dentro de los 5 °C de diferencia entre sí. [8] [9] [10] En 2014, se sugirió un umbral del 79% de similitud para separar subespecies bacterianas. [11]

DDH es una técnica común para bacterias, pero requiere mucha mano de obra, es propensa a errores y técnicamente desafiante. En 2004 se describió una nueva técnica de DDH. Esta técnica utilizó microplacas y ADN marcado colorimétricamente para disminuir el tiempo necesario y aumentar la cantidad de muestras que se pueden procesar. [12] Esta nueva técnica DDH se convirtió en el estándar para la taxonomía bacteriana. [13]

En zoología

Charles Sibley y Jon Ahlquist , pioneros de la técnica, utilizaron la hibridación ADN-ADN para examinar las relaciones filogenéticas de las aves (la taxonomía Sibley-Ahlquist ) y los primates. [14] [15]

En radioactividad

En 1969, Mary Lou Pardue y Joseph G. Gall realizaron uno de esos métodos en la Universidad de Yale mediante radiactividad, en el que implicaba la hibridación de un ADN de prueba radiactivo en solución con el ADN estacionario de una preparación citológica, que se identifica como autorradiografía. [dieciséis]

Reemplazo por secuenciación del genoma.

Los críticos argumentan que la técnica es inexacta para la comparación de especies estrechamente relacionadas, ya que cualquier intento de medir las diferencias entre secuencias ortólogas entre organismos se ve abrumado por la hibridación de secuencias parálogas dentro del genoma de un organismo. [17] [ se necesita una mejor fuente ] [ se necesita una mejor fuente ] La secuenciación de ADN y las comparaciones computacionales de secuencias son ahora generalmente el método para determinar la distancia genética, aunque la técnica todavía se usa en microbiología para ayudar a identificar bacterias. [18]

Métodos in silico

El enfoque moderno consiste en llevar a cabo la hibridación ADN-ADN in silico utilizando genomas total o parcialmente secuenciados . [19] El GGDC y el TYGS desarrollados en DSMZ son las herramientas conocidas más precisas para calcular valores análogos a DDH. [19] Entre otras mejoras algorítmicas, resuelve el problema con secuencias parálogas filtrándolas cuidadosamente de las coincidencias entre las dos secuencias del genoma. El método se ha utilizado para resolver taxones difíciles como Escherichia coli , el grupo Bacillus cereus y Aeromonas . [20] La Comisión Judicial del Comité Internacional de Sistemática de Procariotas ha admitido dDDH como evidencia taxonómica. [21]

Ver también

Referencias

  1. ^ Erko Stackebrandt (8 de septiembre de 2010). Identificación molecular, sistemática y estructura poblacional de procariotas. Medios de ciencia y negocios de Springer. ISBN 978-3-540-31292-5.
  2. ^ Sinden, Richard R. (1994). Estructura y función del ADN. San Diego: Prensa académica. págs. 37–45. ISBN 0-12-645750-6. OCLC  30109829.
  3. ^ Herramientas y técnicas en ciencia biomolecular. Aysha Divan, Janice Royds. Oxford: Prensa de la Universidad de Oxford. 2013.ISBN _ 978-0-19-969556-0. OCLC  818450218.{{cite book}}: CS1 maint: others (link)
  4. ^ Forster, CA; McInnes, JL; Skingle, CC; Symons, RH (11 de febrero de 1985). "Sondas de hibridación no radiactivas preparadas mediante el marcaje químico de ADN y ARN con un reactivo novedoso, la fotobiotina". Investigación de ácidos nucleicos . 13 (3): 745–761. doi :10.1093/nar/13.3.745. ISSN  0305-1048. PMC 341032 . PMID  2582358. 
  5. ^ Capucha, DW; Dow, CS; Verde, PN (1987). "ADN: estudios de hibridación de ADN en metilotrofos facultativos de pigmentación rosa". Revista de Microbiología General . 133 (3): 709–720. doi :10.1099/00221287-133-3-709. ISSN  0022-1287. PMID  3655730.
  6. ^ Socransky, SS; Smith, C.; Martín, L.; Paster, BJ; Dewhirst, FE; Levin, AE (octubre de 1994). "Hibridación ADN-ADN "tablero de ajedrez". BioTechniques . 17 (4): 788–792. ISSN  0736-6205. PMID  7833043.
  7. ^ Además, Alexander F.; von Jan, Mathías; Klenk, Hans-Peter; Goker, Markus (2010). "Hibridación digital ADN-ADN para la delimitación de especies microbianas mediante comparación de secuencias de genoma a genoma". Estándares en Ciencias Genómicas . 2 (1): 117-134. doi :10.4056/sigs.531120. ISSN  1944-3277. PMC 3035253 . PMID  21304684. 
  8. ^ DJ Brenner (1973). "Reasociación del ácido desoxirribonucleico en la taxonomía de bacterias entéricas". Revista Internacional de Bacteriología Sistemática . 23 (4): 298–307. doi : 10.1099/00207713-23-4-298 .
  9. ^ Wayne LG, Brenner DJ, Colwell RR, Grimont PD, Kandler O, Krichevsky MI, Moore LH, Moore WEC, Murray RGE, Stackebrandt E, Starr MP, Trüper HG (1987). "Informe del comité ad hoc sobre conciliación de enfoques de sistemática bacteriana". Revista Internacional de Bacteriología Sistemática . 37 (4): 463–464. doi : 10.1099/00207713-37-4-463 .
  10. ^ Tindall BJ, Rosselló-Mora R, Busse HJ, Ludwig W, Kampfer P (2010). "Notas sobre la caracterización de cepas procariotas con fines taxonómicos". Revista Internacional de Microbiología Sistemática y Evolutiva . 60 (Parte 1): 249–266. doi : 10.1099/ijs.0.016949-0 . hdl : 10261/49238 . PMID  19700448.
  11. ^ Meier-Kolthoff JP, Hahnke RL, Petersen JP, Scheuner CS, Michael VM, Fiebig AF, Rohde CR, Rohde MR, Fartmann BF, Goodwin LA, Chertkov OC, Reddy TR, Pati AP, Ivanova NN, Markowitz VM, Kyrpides NC , Woyke TW, Klenk HP, Göker M (2013). "Secuencia completa del genoma de DSM 30083T, la cepa tipo (U5/41T) de Escherichia coli, y una propuesta para delimitar subespecies en taxonomía microbiana". Estándares en Ciencias Genómicas . 9 : 2. doi : 10.1186/1944-3277-9-2 . PMC 4334874 . PMID  25780495. 
  12. ^ Mehlen, André; Goeldner, Marcia; Ried, Sabine; Stindl, Sibila; Luis, Wolfgang; Schleifer, Karl-Heinz (noviembre de 2004). "Desarrollo de un método rápido de hibridación ADN-ADN basado en perfiles de fusión en microplacas". Microbiología Sistemática y Aplicada . 27 (6): 689–695. doi :10.1078/0723202042369875. ISSN  0723-2020. PMID  15612626.
  13. ^ Huang, Chien-Hsun; Li, Shiao-Wen; Huang, Lina; Watanabe, Koichi (2018). "Identificación y clasificación del grupo Lactobacillus casei". Fronteras en Microbiología . 9 : 1974. doi : 10.3389/fmicb.2018.01974 . ISSN  1664-302X. PMC 6113361 . PMID  30186277. 
  14. ^ Similitudes genéticas: Wilson, Sarich, Sibley y Ahlquist
  15. ^ CG Sibley y JE Ahlquist (1984). "La filogenia de los primates hominoideos, según lo indicado por la hibridación ADN-ADN". Revista de evolución molecular . 20 (1): 2–15. Código Bib : 1984JMolE..20....2S. doi :10.1007/BF02101980. PMID  6429338. S2CID  6658046.
  16. ^ Pardue, Mary Lou y Joseph G Hall. "Hibridación molecular de ADN radiactivo con el ADN de preparaciones citológicas". Kline Biology Tower, Universidad de Yale, 13 de agosto de 1969.
  17. ^ Marcas, Jonathan (9 de mayo de 2007). "Hibridación de ADN en los simios: cuestiones técnicas". Archivado desde el original el 9 de mayo de 2007 . Consultado el 2 de junio de 2019 .
  18. ^ SS Socransky; AD Haffajee; C. Smith; L. Martín; JA Haffajee; NG Uzel; JM Goodson (2004). "Uso de la hibridación ADN-ADN en tablero de ajedrez para estudiar ecosistemas microbianos complejos". Microbiología e Inmunología Oral . 19 (6): 352–362. doi :10.1111/j.1399-302x.2004.00168.x. PMID  15491460.
  19. ^ ab Meier-Kolthoff JP, Auch AF, Klenk HP, Goeker M (2013). "Delimitación de especies basada en secuencia del genoma con intervalos de confianza y funciones de distancia mejoradas". Bioinformática BMC . 14 : 60. doi : 10.1186/1471-2105-14-60 . PMC 3665452 . PMID  23432962. 
  20. ^ Riojas, Marco A.; McGough, Katya J.; Rider-Riojas, Cristin J.; Rastogi, Nalin; Hazbón, Manzour Hernando (1 de enero de 2018). "El análisis filogenómico de las especies del complejo Mycobacterium tuberculosis demuestra que Mycobacterium africanum, Mycobacterium bovis, Mycobacterium caprae, Mycobacterium microti y Mycobacterium pinnipedii son sinónimos heterotípicos posteriores de Mycobacterium tuberculosis". Revista Internacional de Microbiología Sistemática y Evolutiva . 68 (1): 324–332. doi : 10.1099/ijsem.0.002507 . PMID  29205127.
  21. ^ Arahal, David R.; Toro, Carolee T.; Busse, Hans-Jürgen; Christensen, Henrik; Chuvochina, María; Dedysh, Svetlana N.; Fournier, Pierre-Edouard; Konstantinidis, Konstantinos T.; Parker, Charles T.; Rosselló-Mora, Ramón; Ventosa, Antonio; Göker, Markus (27 de abril de 2023). "Opiniones judiciales 123-127". Revista Internacional de Microbiología Sistemática y Evolutiva . 72 (12). doi :10.1099/ijsem.0.005708. hdl : 10261/295959 .

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