Los canales iónicos mecanosensibles de gran conductancia (MscL) (TC# 1.A.22) son una familia de proteínas de membrana formadoras de poros que son responsables de traducir las tensiones en la membrana celular en una respuesta electrofisiológica . MscL tiene una conductancia relativamente grande, 3 nS , lo que lo hace permeable a iones, agua y proteínas pequeñas cuando se abre. [1] MscL actúa como una válvula de liberación osmótica activada por estiramiento en respuesta al choque osmótico . [2]
El gen MscL se descubrió por primera vez en la superficie de los esferoplastos gigantes de Escherichia coli utilizando la técnica de fijación de parche . [3] Posteriormente, el gen MscL de Escherichia coli (Ec-MscL) se clonó en 1994. [4] Después de la clonación de MscL, se obtuvo la estructura cristalina de MscL de Mycobacterium tuberculosis (Tb-MscL) en su conformación cerrada. [5] Además, la estructura cristalina de MscL de Staphylococcus aureus (Sa-MscL) y Ec-MscL se ha determinado utilizando cristalografía de rayos X y modelo molecular respectivamente. [6] [7] Sin embargo, algunas evidencias sugieren que la estructura de Sa-MscL no es fisiológica y se debe al detergente utilizado en la cristalización. [8] [9]
De manera similar a otros canales iónicos , los MscL se organizan como oligómeros simétricos con la vía de permeación formada por el empaquetamiento de subunidades alrededor del eje de simetría rotacional. A diferencia de MscS, que es heptamérico, MscL es probablemente pentamérico; aunque Sa-MscL parece ser un tetrámero en una estructura cristalina, [1] [10] esto puede ser un artefacto. [8] [9] MscL contiene dos hélices transmembrana que están empaquetadas en una topología de arriba-abajo/vecino más cercano. La vía de permeación de MscL tiene aproximadamente forma de embudo, con la abertura más grande orientada hacia la superficie periplásmica de la membrana y el punto más estrecho cerca del citoplasma . En el punto más estrecho, el poro está restringido por las cadenas laterales de residuos relacionados con la simetría en Ec-MscL: Leu 19 y Val 23. [1] El diámetro del poro de MscL en estado abierto se ha estimado en ~3 nm, lo que permite el paso de proteínas pequeñas de hasta 9 kD . [1]
Ec-MscL consta de cinco subunidades idénticas, cada una de 136 aminoácidos de longitud. Cada subunidad cruza la membrana dos veces a través de segmentos transmembrana alfa-helicoidales , M1 y M2, que están interconectados por un bucle extracelular. [2] Forma un canal homopentamérico con diez puentes transmembrana. [11] [12] [13] Combinando tanto el modelo molecular de Ec-MscL como la estructura cristalina de Tb-MscL, queda claro que las hélices M1 en el núcleo del haz transmembrana forman la puerta principal del canal mecanosensible. Los residuos de glicina colocados regularmente en los segmentos M1 permiten un empaquetamiento apretado de las cinco hélices centrales, formando una constricción hidrofóbica estrecha (~4 Å) . Las hélices M2 hidrofóbicas en la periferia del barril de MscL miran hacia la bicapa lipídica. [2] Es importante señalar que las hélices M1 y M2 de la misma subunidad no están conectadas; en cambio, la hélice M1 de una subunidad hace un estrecho contacto con la hélice M2 de la subunidad adyacente. Con interacciones adicionales a través de un puente salino en Ec-MscL, todo el complejo se mantiene unido. [2]
Los dominios S1 N-terminales de Tb-MscL no se resolvieron en la estructura cristalina, solo se dedujeron como hélices α cortas agrupadas para formar una puerta citoplasmática adicional; [7] sin embargo, experimentos posteriores de reticulación de cisteína respaldaron esta configuración propuesta. [14] Se ha demostrado que el segmento S1 puede mutarse en gran medida sin un fuerte efecto perjudicial sobre la función del canal. [15]
Tanto Ec-MscL como Tb-MscL se han sintetizado químicamente y se han reconstituido en membranas vesiculares. Los registros de un solo canal de estas MscL mostraron una conductancia y una dependencia de la presión similares a las de la MscL de tipo salvaje correspondiente. [16]
Los impactos físicos o vibraciones, aunque cruciales para los animales, tienen poco efecto en microbios como E. coli . En comparación, la fuerza osmótica afecta en gran medida a las células individuales o microbios dentro de su entorno acuático. Cuando las bacterias están bajo un choque osmótico , que es durante la transición de un medio de alta osmolaridad a uno de baja, la entrada de agua da lugar a un aumento sustancial de la presión de turgencia , que es capaz de reventar la envoltura celular. Los canales mecanosensibles son vías principales para la liberación de solutos citoplasmáticos para lograr una rápida reducción de la presión de turgencia, evitando así la lisis . Los experimentos de disrupción genética confirmaron que los canales MscL o MscS pueden rescatar a las bacterias de un fuerte choque osmótico, mientras que una doble inactivación de ambos canales provocó la lisis. [2]
El papel de MscL como mecanismo de defensa contra choques osmóticos indica su importancia evolutiva incluso durante la fase temprana de la historia biológica. Junto con MscS , MscL, o sus homólogos, se ha encontrado en bacterias , arqueas , hongos y plantas superiores, pero no en animales. [17] [18] Aunque los canales mecanosensibles bacterianos y arqueológicos difieren en propiedades conductivas y mecanosensibles, comparten mecanismos de compuerta similares desencadenados por la fuerza mecánica transmitida a través de la bicapa lipídica. [17] Aunque MscL y MscS comparten un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático similares, las disposiciones generales de los pliegues polipeptídicos en estos canales MS son distintas, lo que indica que no comparten un ancestro evolutivo común. [1]
Los canales mecanosensibles bacterianos, MscL y MscS, reflejan un acoplamiento íntimo de la conformación de la proteína con la mecánica de la membrana circundante. La membrana actúa como un sensor adaptable que responde a una entrada de fuerza aplicada y la convierte en una señal de salida. La célula puede aprovechar esta información de diversas maneras: asegurando la viabilidad celular en presencia de estrés osmótico y quizás también sirviendo como un transductor de señales para la tensión de la membrana. [1]
Los estudios han demostrado que el poro de MscL se expande hasta alcanzar un diámetro de ~30 Å cuando está cerrado, con un cambio de 15-16 Å al abrirse, que es el mayor cambio conformacional conocido en las proteínas de canal. [19] Este gran cambio explica la apertura del poro de 30 Å de diámetro, lo que da como resultado una expansión de proteína en el plano de 20 nm 2 . Tal transformación es responsable de la conductancia unitaria de MscL de 3 nS y la falta de selectividad del canal, lo que permite el paso de cualquier partícula con un peso molecular inferior a ~1000. Esta propiedad de MscL cumple su función como válvula de emergencia para liberar solutos bajo choque osmótico. [18]
Se han propuesto dos modelos para explicar el mecanismo de apertura de los canales MS: el mecanismo mediado por membrana y el mecanismo de trampilla. El mecanismo de trampilla es responsable de la apertura de los canales iónicos en las células pilosas . Sin embargo, más evidencia ahora indica que la apertura de los canales MS está moderada específicamente por el mecanismo mediado por membrana, que depende de cambios en el espesor o la curvatura de la membrana que pueden alterar el equilibrio energético de las proteínas incrustadas. Esto está respaldado por las observaciones de que las variaciones en el espesor de la bicapa de fosfolípidos o la adición de compuestos que inducen la curvatura espontánea de la membrana impactan directamente en la tensión requerida para abrir los canales MS. [20]
El análisis del perfil de presión lateral en la bicapa lipídica mostró que la región de la interfaz entre los grupos de hidrocarburos y cabeza polar produce una alta tensión. Por lo tanto, cuando la membrana se estira, MscL experimentará una tracción concentrada principalmente en las regiones interfaciales. [2] Las mutaciones que afectan las interacciones proteína-lípido cerca de las interfaces resultan en fenotipos de pérdida de función. [15] [21]
La tensión aplicada a los bordes interno y externo del canal por la bicapa lipídica inclina las hélices transmembrana de MscL (las inclinaciones de las hélices M1 cambian entre 35 y 34 ° durante la transición), lo que provoca una expansión gradual similar a un iris y un aplanamiento del barril de MscL. [22] Como resultado, se reduce la extensión transmembrana de las hélices M2, tirando de los bucles periplásmicos hacia la membrana para revestir la entrada extracelular al poro, estableciendo un diámetro de poro de ~3 nm. [22] Junto con esta transición similar a un iris, el poro ahora está revestido principalmente por facetas polares de hélices M1, en lugar de la constricción hidrófoba durante el estado cerrado. Una vez que el poro está hidratado, el barril de MscL ejerce más fuerza sobre los enlaces S1-M1, separando el haz S1 y abriendo completamente el canal. [2]
Anteriormente se creía que Ec-MscS exhibe un comportamiento adaptativo complejo, mientras que Ec-MscL no. Un estudio reciente mostró que tanto Ec-MscS como Ec-MscL son capaces de un comportamiento adaptativo bajo estímulos de presión constante en un parche de membrana extirpado; sin embargo, ambos canales mecanosensibles pierden la capacidad adaptativa en registros de células completas, lo que indica que el comportamiento adaptativo previamente conocido de Ec-MscS está relacionado con la relajación del estrés de la membrana en lugar de la estructura específica del canal. [23] Este resultado enfatiza aún más la importancia de la interacción proteína-membrana para los canales mecanosensibles.
Las reacciones de transporte generalizadas son:
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