La serología forense es la detección, identificación, clasificación y estudio de diversos fluidos corporales como sangre , semen , saliva y orina , y su relación con la escena de un crimen. Un serólogo forense también puede participar en el análisis de ADN y el análisis de patrones de manchas de sangre . [1] [2] Las pruebas serológicas comienzan con pruebas presuntivas que le dan al analista una indicación de que puede estar presente un fluido corporal específico, pero no pueden confirmar completamente su presencia. Después de las pruebas presuntivas, se realizan pruebas confirmatorias en la misma muestra para confirmar qué es realmente la sustancia desconocida. [3]
La sangre está compuesta de plasma líquido y suero con componentes sólidos que consisten en glóbulos rojos ( eritrocitos ), glóbulos blancos ( leucocitos ) y plaquetas ( trombocitos ). [4] Para detectar sangre en la escena de un crimen o en el laboratorio, se puede utilizar una serie de pruebas. La prueba más publicitada por los programas de crímenes es el proceso Luminol en el que se rocía una sustancia química sobre una superficie donde se sospecha que hay sangre. [4] La sustancia química reacciona con trazas de sangre, produciendo una quimioluminiscencia o brillo aparente, como resultado de la reacción química que ocurre. Al igual que con todas las pruebas presuntivas, esta técnica puede producir resultados falsos positivos debido a metales y sustancias químicas fuertes, como la lejía, que también reaccionarán. Otra prueba presuntiva común es la prueba de Kastle-Meyer o fenolftaleína . Esta es una prueba catalítica que detecta el grupo hemo en la sangre que transporta oxígeno y dióxido de carbono. [5] Se empapa un hisopo de algodón estéril en agua destilada y se aplica al área donde se sospecha que hay sangre para recoger algo de la muestra. [5] Se aplica una gota de alcohol al hisopo, seguido de la adición de una gota del reactivo de fenolftaleína, seguido de una gota de peróxido de hidrógeno. [6] Un resultado positivo induce un cambio de color a rosa. [4] Similar a la prueba de Kastle-Meyer, un hemastix también es una prueba catalítica simplificada a una tira especializada donde la muestra de sangre se extrae con un hisopo húmedo y se coloca directamente en el hemastix. [7] Un resultado positivo induce un cambio de color de amarillo a verde oscuro. [7]
Para las pruebas confirmatorias, se utilizan típicamente el ensayo de cristal de Takayama o una prueba inmunocromatográfica . El ensayo de cristal de Takayama, que forma un anillo de ferroprotoporfirina mediante una reacción entre la piridina y el átomo de hierro del grupo hemo . [8] El reactivo de Takayama se agrega a un portaobjetos con una muestra de sangre presuntiva. El portaobjetos se seca a 115 grados Celsius después de la adición del reactivo de Takayama. Luego se coloca bajo un microscopio y un resultado positivo es la visualización de cristales plumosos de color rojo oscuro. [3] Para la prueba inmunocromatográfica, funciona de manera similar a una prueba de embarazo donde se detectan antígenos presentes en la sangre y un resultado positivo es una banda en el sitio de prueba y el sitio de control. [9] Después de realizar las diversas pruebas, un analista puede confirmar la presencia de sangre humana y continuar desarrollando un perfil de ADN con aplicaciones posteriores como extracción de ADN , reacción en cadena de la polimerasa (PCR), electroforesis capilar (CE), etc., seguida de la interpretación del perfil.
El semen es un líquido incoloro que se eyacula del pene de un hombre debido a la excitación sexual . Para detectar inicialmente el semen, se utiliza una fuente de luz alternativa (ALS). [3] Bajo la luz ultravioleta, el semen emite fluorescencia, lo que lo hace visible para los investigadores que recolectan muestras de la escena de un crimen. Una prueba presuntiva común para detectar el semen se llama prueba de fosfatasa ácida (AP). [3] La prueba de AP detecta la enzima fosfatasa ácida que se secreta de la glándula prostática. [4] Sin embargo, esta prueba solo es presuntiva porque la fosfatasa ácida se encuentra en otros fluidos corporales. [4] Para realizar la prueba, se agrega una gota del reactivo alfa-naftifosfato de sodio a la tinción presuntiva seguida de una gota de azul rápido B. Un resultado positivo de esta prueba es un cambio de color a violeta oscuro. [4] [3]
Las pruebas de confirmación del semen incluyen la tinción de árbol de Navidad y el kit p30/PSA RSID. Para la tinción de árbol de Navidad, la muestra se extrae con agua esterilizada para hacer un montaje húmedo en un portaobjetos de microscopio. Luego, la muestra se fija con calor al portaobjetos y se tiñe con rojo nuclear rápido durante 15 minutos, luego se enjuaga con agua desionizada. [8] A continuación, se aplica una tinción verde durante 10 segundos, luego se enjuaga con etanol. El portaobjetos se coloca bajo un microscopio óptico compuesto para observar los espermatozoides. Si hay espermatozoides presentes, las cabezas se tiñen de rojo y la parte media y la cola se tiñen de verde. [8] Sin embargo, no todos los machos liberan espermatozoides en su semen. Si un macho es aspérmico u oligospérmico, no tiene espermatozoides o tiene un recuento bajo de espermatozoides. [10] Los machos vasectomizados tampoco liberan espermatozoides. [4] Cuando no hay espermatozoides presentes, se realiza una segunda prueba de confirmación, la prueba p30/PSA. [3]
El PSA(p30) es un antígeno prostático específico producido por la glándula prostática en los hombres. [9] La prueba p30/PSA es una prueba inmunocromatográfica que detecta la presencia del antígeno p30 en muestras de semen. Esta prueba funciona de manera similar a una prueba de embarazo, donde si el antígeno p30 está presente, aparecerá una banda en el sitio de la prueba y una banda de control para confirmar si la prueba está funcionando correctamente. [4] Si la prueba confirmatoria es positiva, entonces hay semen presente en la muestra. A partir de allí, un analista podría continuar desarrollando un perfil de ADN con aplicaciones posteriores.
Una prueba presuntiva para detectar la saliva es la prueba de la alfa-amilasa, también conocida como prueba de Phadebas. [4] Esta técnica de detección se basa en la actividad de la enzima alfa-amilasa, que descompone los almidones de los alimentos en moléculas de oligosacáridos más pequeñas, iniciando la digestión en la boca. [11] Utilizando un gel de placa de Petri, se añade la muestra de saliva y se deja difundir a través del gel durante la noche. La visualización se logra añadiendo yodo al gel, que tiñe el almidón del gel de azul. Si hay saliva presente, la alfa-amilasa descompone el almidón, creando un círculo de color claro alrededor del lugar donde se colocó la muestra. También se han realizado pruebas RSID para detectar la alfa-amilasa, pero no siempre son fiables porque puede haber muchos falsos positivos. [3]
En cuanto a las pruebas confirmatorias, no se han realizado tantas investigaciones en comparación con las pruebas de sangre y semen. Dado que estas pruebas se centran específicamente en la amilasa, no se pueden realizar pruebas confirmatorias considerando que la amilasa se puede encontrar en otros fluidos corporales. [12]
La detección presuntiva de orina se puede realizar mediante fuentes de luz alternativas o una prueba de paradimetilaminocinamaldehído (DMAC). [13] El DMAC reaccionará con urea, ácido úrico o amoníaco, que se pueden encontrar en la orina. [13] Cuando se encuentra una muestra con orina potencial, se puede aplicar DMAC al 0,1%. Si hay una reacción positiva, aparecerá un color rosa/magenta en la mancha. [13] Solo existen pruebas presuntivas para la detección de orina porque las pruebas utilizan material objetivo que se puede encontrar en otros fluidos corporales. Esto puede causar muchos falsos positivos y resultados inexactos. [13]
Es posible realizar pruebas para detectar diferentes fluidos corporales con técnicas serológicas tradicionales, como las mencionadas anteriormente, pero no sin algunos inconvenientes. En primer lugar, no todos los fluidos corporales tienen una prueba confirmatoria confiable, y aquellos que sí la tienen generalmente requieren una mayor cantidad de la tinción sospechosa para realizar la prueba confirmatoria. Esto puede ser limitante si la muestra forense que se está analizando es pequeña para empezar. Además, la serología a menudo se realiza antes de cualquier análisis posterior como el de ADN, por lo que si la muestra es limitada en tamaño para empezar, es posible que no sea posible realizar análisis serológicos y obtener un perfil de ADN con éxito. Actualmente, los investigadores están buscando formas de identificar fluidos corporales con más éxito y con menos muestra necesaria, y una forma emergente de hacerlo es con micro ARN.
Los micro ARN ( miARN ) son ARN monocatenarios pequeños y no codificantes que se utilizan para regular la expresión genética, ya sea regulando la traducción (síntesis de proteínas) o marcando el ARN mensajero (ARNm) para su degradación. [14] Dada su función reguladora, la teoría es que diferentes miARN estarían presentes en diferentes cantidades en ciertos tipos de fluidos o tejidos porque cada uno de esos tipos de tejido debería tener proteínas y ARNm únicos en función de su función en el cuerpo. Los miARN también son un objetivo ideal para el análisis forense porque son pequeños en comparación con otros componentes celulares, por lo que tienden a resistir la degradación mejor que otros marcadores de tejidos, lo que es importante considerando que las muestras de trabajo de casos no siempre estarán en perfectas condiciones. [14] Finalmente, los miARN tienen el potencial de ser coextraídos y analizados al mismo tiempo que el ADN, combinando los dos procesos en uno para el análisis de muestras biológicas, ahorrando tiempo y muestra.
El miRNA se puede extraer utilizando varios kits disponibles comercialmente, como el minikit Solid Phase QIAmp DNA. [15] Idealmente, al igual que el kit QIAmp, el método de extracción utilizado es capaz de extraer ADN y miRNA simultáneamente, minimizando la cantidad de reacciones y la cantidad de muestra utilizada. Los miRNA se pueden cuantificar utilizando PCR cuantitativa en tiempo real, similar a las muestras de ADN tradicionales. [16] Sin embargo, los cebadores y las sondas tendrían que estar diseñados para los objetivos de miRNA para poder hacerlo. A diferencia del perfil de ADN de rutina , la amplificación de miRNA requiere un paso adicional antes del proceso de PCR. miRNA requiere un paso de transcripción inversa para convertir los fragmentos de miRNA en sus fragmentos de ADN complementario ( ADNc ). [15] Una vez que se ha producido esta conversión, el ADNc y el otro ADN en la muestra se pueden amplificar mediante PCR y luego separar/visualizar utilizando un protocolo de electroforesis capilar. Los cebadores específicos de ADNc tendrían que estar diseñados para sus objetivos de miRNA. El resultado final es un electroferograma que contiene no solo el perfil STR de la muestra, sino también un pico que representa qué miRNA está presente en esa muestra. [15]
Posibles biomarcadores de miRNA actuales: aún se necesitan investigaciones para delimitar los posibles biomarcadores, ya que algunos tejidos y fluidos tienen el mismo miRNA expresado en diferentes concentraciones. Hasta la fecha, los miRNA de la sangre y el semen han sido los más estudiados y se han encontrado candidatos prometedores para biomarcadores.
Al igual que la técnica de extracción de miRNA, los investigadores han podido analizar una o más muestras extrayendo ADN y analizándolo en un instrumento que la mayoría de los laboratorios tienen a su disposición. Se ha demostrado que este método produce más ADN que la amplificación basada en PCR. Los investigadores también han añadido otros factores a la amplificación isotérmica mediada por bucle para la identificación de diferentes fluidos corporales. El uso de LAMP ha reducido el tiempo necesario para obtener resultados, que era el objetivo final. Aunque se ha demostrado que disminuye el tiempo total y práctico necesario para obtener un resultado, todavía quedan algunos problemas por resolver antes de que este método se utilice en muchos o todos los laboratorios forenses.