La lipidómica es el estudio a gran escala de las vías y redes de lípidos celulares en sistemas biológicos. [1] [2] [3] La palabra " lipidoma " se utiliza para describir el perfil lipídico completo dentro de una célula, tejido, organismo o ecosistema y es un subconjunto del " metaboloma " que también incluye otras clases importantes de moléculas biológicas (como aminoácidos, azúcares, intermediarios de glucólisis y TCA, y ácidos nucleicos). La lipidómica es un campo de investigación relativamente reciente que ha sido impulsado por rápidos avances en tecnologías como la espectrometría de masas (MS), la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN), la espectroscopia de fluorescencia , la interferometría de polarización dual y los métodos computacionales, junto con el reconocimiento del papel de los lípidos en muchas enfermedades metabólicas como la obesidad , la aterosclerosis , el accidente cerebrovascular , la hipertensión y la diabetes . Este campo en rápida expansión [4] complementa el enorme progreso logrado en genómica y proteómica, todas las cuales constituyen la familia de la biología de sistemas .
La investigación en lipidómica implica la identificación y cuantificación de miles de especies moleculares de lípidos celulares y sus interacciones con otros lípidos, proteínas y otros metabolitos . Los investigadores en lipidómica examinan las estructuras, funciones, interacciones y dinámicas de los lípidos celulares y los cambios que ocurren durante la perturbación del sistema.
Han y Gross [5] definieron por primera vez el campo de la lipidómica mediante la integración de las propiedades químicas específicas inherentes a las especies moleculares de lípidos con un enfoque espectrométrico de masas integral. Aunque la lipidómica se encuentra bajo el paraguas del campo más general de la " metabolómica ", la lipidómica en sí misma es una disciplina distinta debido a la singularidad y especificidad funcional de los lípidos en relación con otros metabolitos.
En la investigación lipidómica, se obtiene una gran cantidad de información que describe cuantitativamente las alteraciones espaciales y temporales en el contenido y la composición de diferentes especies moleculares de lípidos después de la perturbación de una célula a través de cambios en su estado fisiológico o patológico. La información obtenida de estos estudios facilita la comprensión mecanicista de los cambios en la función celular. Por lo tanto, los estudios lipidómicos desempeñan un papel esencial en la definición de los mecanismos bioquímicos de los procesos patológicos relacionados con los lípidos mediante la identificación de alteraciones en el metabolismo, el tráfico y la homeostasis de los lípidos celulares. La creciente atención a la investigación de los lípidos también se ve en las iniciativas en curso de la Estrategia de Metabolitos y Vías de los Lípidos ( Consorcio LIPID MAPS ) [6] y la Iniciativa Europea de Lipidomía (ELIfe). [7]
Los lípidos son un grupo diverso y ubicuo de compuestos que tienen muchas funciones biológicas clave, como actuar como componentes estructurales de las membranas celulares , servir como fuentes de almacenamiento de energía y participar en las vías de señalización. Los lípidos pueden definirse ampliamente como pequeñas moléculas hidrófobas o anfipáticas que se originan total o parcialmente a partir de dos tipos distintos de subunidades bioquímicas o "bloques de construcción": grupos cetoacilo e isopreno . [8] La enorme diversidad estructural encontrada en los lípidos surge de la biosíntesis de varias combinaciones de estos bloques de construcción. Por ejemplo, los glicerofosfolípidos están compuestos de una cadena principal de glicerol unida a uno de aproximadamente 10 grupos de cabeza posibles y también a 2 cadenas de acilo graso / alquilo , que a su vez pueden tener 30 o más estructuras moleculares diferentes. En la práctica, no todas las permutaciones posibles se detectan experimentalmente, debido a las preferencias de cadena que dependen del tipo de célula y también a los límites de detección; sin embargo, se han detectado varios cientos de especies moleculares distintas de glicerofosfolípidos en células de mamíferos .
Sin embargo, las membranas tilacoides de los cloroplastos de las plantas tienen una composición lipídica única , ya que son deficientes en fosfolípidos. Además, su componente más grande, el monogalactosil diglicérido o MGDG , no forma bicapas acuosas. No obstante, los estudios dinámicos revelan una organización normal de la bicapa lipídica en las membranas tilacoides. [9]
La mayoría de los métodos de extracción y aislamiento de lípidos de muestras biológicas explotan la alta solubilidad de las cadenas de hidrocarburos en solventes orgánicos . Dada la diversidad en las clases de lípidos, no es posible acomodar todas las clases con un método de extracción común. El procedimiento tradicional de Bligh/Dyer [10] utiliza protocolos basados en cloroformo / metanol que incluyen la partición de fases en la capa orgánica. Sin embargo, ahora existen varios protocolos, con métodos más nuevos que superan las deficiencias de los antiguos y resuelven problemas asociados con, por ejemplo, el aislamiento de lípidos dirigido o la recopilación de datos de alto rendimiento [11] . La mayoría de los protocolos funcionan relativamente bien para una variedad de lípidos fisiológicamente relevantes, pero deben adaptarse para especies con propiedades particulares y metabolitos lipídicos de baja abundancia y lábiles [12] [13] [14] [15] [16] [17] .
El método más simple de separación de lípidos es el uso de cromatografía de capa fina (TLC). Aunque no es tan sensible como otros métodos de detección de lípidos, ofrece una herramienta de detección rápida y completa antes de técnicas más sensibles y sofisticadas. La cromatografía de extracción en fase sólida (SPE) es útil para la separación rápida y preparativa de mezclas de lípidos crudos en diferentes clases de lípidos. Esto implica el uso de columnas preempacadas que contienen sílice u otras fases estacionarias para separar glicerofosfolípidos , ácidos grasos , ésteres de colesterilo , glicerolípidos y esteroles de mezclas de lípidos crudos. [18] La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC o LC) se usa ampliamente en el análisis lipidómico para separar lípidos antes del análisis de masas. La separación se puede lograr mediante HPLC de fase normal (NP) o HPLC de fase inversa (RP). Por ejemplo, la NP-HPLC separa eficazmente los glicerofosfolípidos sobre la base de la polaridad del grupo de cabeza, [19] mientras que la RP-HPLC separa eficazmente los ácidos grasos como los eicosanoides sobre la base de la longitud de la cadena, el grado de insaturación y la sustitución. [20] Para estudios lipidómicos globales, no dirigidos, es común utilizar columnas RP y NP o de cromatografía líquida de interacción hidrofílica (HILC) para aumentar la cobertura del lipidoma. La aplicación de la cromatografía líquida de nanoflujo (nLC) demostró ser así más eficiente para mejorar tanto la sensibilidad de medición general como la cobertura del lipidoma para un enfoque lipidómico global. [21] La separación cromatográfica (HPLC/UHPLC) de lípidos puede realizarse fuera de línea o en línea donde el eluido se integra con la fuente de ionización de un espectrómetro de masas.
El progreso de la lipidómica moderna se ha acelerado enormemente gracias al desarrollo de métodos espectrométricos en general y técnicas de ionización suave para espectrometría de masas, como la ionización por electrospray (ESI), [5] la ionización por electrospray de desorción (DESI), [22] y la desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI) [23] en particular. La ionización "suave" no causa una fragmentación extensa, de modo que la detección integral de una gama completa de lípidos dentro de una mezcla compleja se puede correlacionar con las condiciones experimentales o el estado de la enfermedad. Además, la técnica de ionización química a presión atmosférica (APCI) se ha vuelto cada vez más popular para el análisis de lípidos no polares. [24]
Fenn y sus colegas desarrollaron inicialmente la ESI-MS para el análisis de biomoléculas. [25] Depende de la formación de iones gaseosos a partir de moléculas polares, térmicamente lábiles y en su mayoría no volátiles y, por lo tanto, es completamente adecuada para una variedad de lípidos. Es un método de ionización suave que rara vez altera la naturaleza química del analito antes del análisis de masas. Se han desarrollado varios métodos de ESI-MS para el análisis de diferentes clases, subclases y especies lipídicas individuales a partir de extractos biológicos. Recientemente se han publicado revisiones exhaustivas de los métodos y su aplicación. [26] Las principales ventajas de la ESI-MS son la alta precisión, sensibilidad, reproducibilidad y la aplicabilidad de la técnica a soluciones complejas sin derivatización previa. Han y sus colaboradores han desarrollado un método conocido como "lipidómica de escopeta" que implica la infusión directa de un extracto lipídico crudo en una fuente de ESI optimizada para la separación intrafuente de lípidos en función de sus propiedades eléctricas intrínsecas. [27]
La espectrometría de masas DESI es una técnica de ionización ambiental desarrollada por el profesor Zoltan Takáts, et al., en el grupo del profesor Graham Cooks de la Universidad de Purdue . [22] Combina las técnicas de ESI y de ionización por desorción, al dirigir una niebla cargada eléctricamente a la superficie de la muestra que se encuentra a unos pocos milímetros de distancia. [28] La técnica se ha aplicado con éxito a la lipidómica como herramienta de obtención de imágenes para mapear las distribuciones de lípidos dentro de muestras de tejido. [29] Una de las ventajas de DESI MS es que no se requiere una matriz para la preparación del tejido, lo que permite múltiples mediciones consecutivas en la misma muestra de tejido. DESI MS también se puede utilizar para la obtención de imágenes de lípidos a partir de secciones de tejido. [30]
La espectrometría de masas MALDI es un método de ionización suave basado en láser que se utiliza a menudo para el análisis de proteínas grandes, pero que se ha utilizado con éxito para los lípidos. El lípido se mezcla con una matriz, como el ácido 2,5-dihidroxibenzoico, y se aplica a un portamuestras como un pequeño punto. Se dispara un láser en el punto y la matriz absorbe la energía, que luego se transfiere al analito, lo que da como resultado la ionización de la molécula. La espectrometría de masas MALDI-tiempo de vuelo (MALDI-TOF) se ha convertido en un enfoque muy prometedor para los estudios de lipidómica, en particular para la obtención de imágenes de lípidos a partir de portaobjetos de tejido. [31]
La fuente de APCI es similar a la de ESI, excepto que los iones se forman por la interacción del solvente del analito calentado con una aguja de descarga de corona ajustada a un alto potencial eléctrico. Los iones primarios se forman inmediatamente alrededor de la aguja y estos interactúan con el solvente para formar iones secundarios que finalmente ionizan la muestra. APCI es particularmente útil para el análisis de lípidos no polares como triacilgliceroles, esteroles y ésteres de ácidos grasos. [32]
La alta sensibilidad de DESI en el rango de lípidos lo convierte en una técnica poderosa para la detección y el mapeo de abundancias de lípidos dentro de muestras de tejido. [33] Los desarrollos recientes en métodos MALDI han permitido la detección directa de lípidos in situ. Los iones abundantes relacionados con lípidos se producen a partir del análisis directo de cortes finos de tejido cuando se adquieren espectros secuenciales a lo largo de una superficie de tejido que ha sido recubierta con una matriz MALDI. La activación por colisión de los iones moleculares se puede utilizar para determinar la familia de lípidos y, a menudo, definir estructuralmente las especies moleculares. Estas técnicas permiten la detección de fosfolípidos, esfingolípidos y glicerolípidos en tejidos como el corazón, los riñones y el cerebro. Además, la distribución de muchas especies moleculares de lípidos diferentes a menudo define regiones anatómicas dentro de estos tejidos. [34] [35]
El perfil lipídico es una plataforma metabolómica dirigida que proporciona un análisis integral de las especies lipídicas dentro de una célula o tejido. El perfil basado en espectrometría de masas en tándem con ionización por electrospray (ESI-MS/MS) es capaz de proporcionar datos cuantitativos y es adaptable a análisis de alto rendimiento. [37] El poderoso enfoque de los transgénicos, es decir, la eliminación y/o sobreexpresión de un producto génico junto con la lipidómica, puede brindar información valiosa sobre el papel de las vías bioquímicas. [38] Las técnicas de perfil lipídico también se han aplicado a plantas [39] y microorganismos como la levadura. [36] [40] [21] Una combinación de datos lipidómicos cuantitativos junto con los datos transcripcionales correspondientes (utilizando métodos de matriz de genes) y datos proteómicos (utilizando MS en tándem) permite un enfoque de biología de sistemas para una comprensión más profunda de las vías metabólicas o de señalización de interés.
Un desafío importante para la lipidómica, en particular para los enfoques basados en MS, radica en las demandas computacionales y bioinformáticas de manejar la gran cantidad de datos que surgen en varias etapas a lo largo de la cadena de adquisición y procesamiento de información. [41] [42] La recopilación de datos cromatográficos y de MS requiere esfuerzos sustanciales en la alineación espectral y la evaluación estadística de las fluctuaciones en las intensidades de la señal. Dichas variaciones tienen una multitud de orígenes, incluidas las variaciones biológicas, el manejo de la muestra y la precisión analítica. Como consecuencia, normalmente se requieren varias réplicas para la determinación confiable de los niveles de lípidos en mezclas complejas. En los últimos años, varias empresas y grupos de investigación han desarrollado una serie de paquetes de software para analizar los datos generados por el perfil de MS de metabolitos, incluidos los lípidos. El procesamiento de datos para el perfil diferencial generalmente pasa por varias etapas, incluida la manipulación del archivo de entrada, el filtrado espectral, la detección de picos, la alineación cromatográfica, la normalización, la visualización y la exportación de datos. Un ejemplo de software de perfil metabólico es la aplicación Mzmine basada en Java de libre acceso. [43] Otra es la aplicación comercial de Metabolon, Inc. para el análisis metabolómico utilizando software propietario. [44] Recientemente, el software MS-DIAL 4 se integró con un atlas de lipidomas completo con información sobre el tiempo de retención, la sección transversal de colisión y la espectrometría de masas en tándem para 117 subclases de lípidos y 8051 lípidos. [45] Algunos paquetes de software como Markerview [46] incluyen análisis estadístico multivariado (por ejemplo, análisis de componentes principales) y estos serán útiles para la identificación de correlaciones en metabolitos de lípidos que están asociados con un fenotipo fisiológico, en particular para el desarrollo de biomarcadores basados en lípidos. Otro objetivo del lado de la tecnología de la información de la lipidómica implica la construcción de mapas metabólicos a partir de datos sobre estructuras de lípidos y proteínas y genes relacionados con lípidos. Algunas de estas vías de lípidos [47] son extremadamente complejas, por ejemplo, la vía de los glicoesfingolípidos de los mamíferos. [48] El establecimiento de bases de datos interactivas y de búsqueda [49] [50] de lípidos y genes/proteínas relacionados con los lípidos también es un recurso extremadamente importante como referencia para la comunidad de lipidómica. La integración de estas bases de datos con datos de EM y otros datos experimentales, así como con redes metabólicas [51] ofrece una oportunidad para diseñar estrategias terapéuticas para prevenir o revertir estos estados patológicos que implican disfunción de los procesos relacionados con los lípidos.
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