La batroxobina , también conocida como reptilasa, es una enzima del veneno de serpiente con actividad Venombin A producida por Bothrops atrox y Bothrops moojeni , especies venenosas de víbora de foseta que se encuentran al este de los Andes en América del Sur. Es una hemotoxina que actúa como una serina proteasa de manera similar a la trombina , y ha sido objeto de muchos estudios médicos como reemplazo de la trombina. Diferentes enzimas , aisladas de diferentes especies de Bothrops , han sido llamadas batroxobina, pero a menos que se indique lo contrario, este artículo cubre la batroxobina producida por B. moojeni , ya que esta es la variedad más estudiada.
Bothrops atrox fue descrito por Carl Linnaeus ya en 1758, pero la batroxobina, el compuesto activo de su veneno, fue descrita por primera vez recién en 1954 por H. Bruck y G. Salem. [1] En los años siguientes, se demostró que esta primera descripción de la batroxobina tenía varios usos en cirugía. Debido al creciente interés en las propiedades de la batroxobina, se han publicado varios estudios sobre su efecto hemostático y coagulación . Más recientemente, en 1979, un estudio alemán mostró los usos de la batroxobina (prueba de retracción del coágulo de reptilasa) como prueba de reemplazo para el tiempo de trombina más comúnmente utilizado . [2] Debido a que la enzima no se ve afectada por la heparina, se usa principalmente cuando hay heparina presente en la sangre. Estudios recientes enfatizan más en mejorar sus usos en cirugía, principalmente cirugía de columna, y los usos como serina proteasa.
La batroxobina es una proteína de la familia de las serina proteasas. La batroxobina está estrechamente relacionada con la trombina en cuanto a función fisiológica y tamaño molecular. Se han encontrado cinco subespecies de la serpiente brasileña (Bothrops atrox). La batroxobina obtenida de ciertas subespecies exhibe eficacia hemostática, mientras que la proteína obtenida de otras subespecies exhibe la escisión del fibrinógeno. Algunas de las formas tienen como efecto principal la eficacia hemostática, mientras que las otras formas tienen como efecto principal la degradación del fibrinógeno. La batroxobina que se extrae naturalmente del veneno de serpiente se obtiene principalmente de la serpiente Bothrops moojeni . Pero la concentración es baja y es difícil purificar la proteína. A menudo, el producto permanece contaminado, lo que dificulta su uso con fines clínicos. En teoría, el peso molecular de la batroxobina debería rondar los 25,5 kDa. A menudo, la batroxobina aislada es más pesada, alrededor de 33 kDa. El mayor peso molecular se debe a una modificación de la glicosilación durante la secreción. Las diferencias de peso son resultado de distintos procedimientos de purificación posibles, que pueden eliminar diferentes azúcares (cadenas) de la enzima. Debido a que la batroxobina aislada del veneno tiene una calidad muy irregular, ahora se sintetiza con mayor frecuencia en organismos utilizando ADNc de Bothrops moojeni . [3]
La estructura y el mecanismo de acción de la batroxobina extraída de Bothrops moojeni se han estudiado a fondo. Existen varias subespecies y los mecanismos de acción de cada batroxobina difieren. Como tal, la estructura de la batroxobina de Bothrops moojeni se elucida aún más. La estructura de la batroxobina ha sido estudiada por varios grupos de investigación a lo largo de los años. Estos estudios se han realizado principalmente mediante la síntesis biológica de batroxobina a partir del ADNc de Bothrops moojeni , y el análisis de este producto y el uso de modelos de homología basados en otras proteasas, como la trombina y la tripsina, entre otras. Uno de los primeros estudios de 1986 mostró que el peso molecular es de 25,503 kDa, 32,312 kDa con el carbohidrato, y consta de 231 aminoácidos. [4] La secuencia de aminoácidos exhibió una homología significativa con otras serina proteasas de mamíferos conocidas, como la tripsina, la trombina y, más notablemente, la calicreína pancreática. Por lo tanto, se concluyó que efectivamente es un miembro de la familia de las serina proteasas. Basándose en la homología, se identificaron los puentes disulfuro y se dilucidó más la estructura. Un estudio de modelado molecular posterior de 1998 utilizó la homología entre la calicreína glandular del ratón y la batroxobina, que es de alrededor del 40%, para proponer una estructura 3D para la batroxobina biológicamente activa. Hasta la fecha, no se ha propuesto ninguna estructura 3D definitiva. [5]
Después de que la secuencia de nucleótidos del ADNc de la batroxobina de Bothrops moojeni se determinara en 1986, un grupo de investigación de la Universidad Sangyo de Kioto expresó con éxito el ADNc de la batroxobina en E. Coli en 1990 [3] . La secuencia de reconocimiento de la trombina se utilizó para obtener batroxobina madura. La proteína de fusión que se obtuvo era insoluble y se purificó fácilmente. Después de escindir la proteína de fusión, la batroxobina recombinante se pudo aislar por electroforesis y luego se replegó con éxito para producir batroxobina biológicamente activa. Este estudio demostró que era posible producir batroxobina utilizando microorganismos, un método que era más prometedor que aislar la enzima del veneno de serpiente extraído. En 2004, un grupo de investigación de Corea produjo batroxobina expresándola en la especie de levadura Pichia pastoris . [6] Esta enzima recombinante tenía un peso molecular de 33 kDa e incluía la estructura de carbohidratos. Este método de expresión en Pichia pastoris resultó ser más eficaz, ya que la enzima producida mostró una actividad de escisión que fue más específica que la trombina en algunos casos y fue más específica que la batroxobina no recombinante. Por lo tanto, la síntesis utilizando Pichia pastoris parece prometedora para producir batroxobina recombinante de alta calidad.
Como se describió anteriormente, la batroxobina es una enzima que tiene una actividad de serina proteasa en su sustrato, el fibrinógeno. Una serina proteasa escinde una proteína en la posición de una serina, para degenerar una proteína. La batroxobina es comparable a la enzima trombina, que también es una serina proteasa para el fibrinógeno. El fibrinógeno es una proteína importante para la hemostasia, porque desempeña un papel fundamental en la agregación plaquetaria y la formación de coágulos de fibrina. Normalmente, cuando alguien resulta herido, la trombina escinde el fibrinógeno, que forma coágulos. Como resultado, la herida se "cierra" mediante estos coágulos y puede tener lugar la recuperación de las células epiteliales de la piel. Este es el proceso natural necesario para la reparación de los tejidos. El veneno de la batroxobina también induce coágulos, pero lo hace con o sin daño tisular. Esto se debe a que la batroxobina no es inhibida por cofactores específicos como lo es la trombina. Estos coágulos pueden bloquear una vena y dificultar el flujo sanguíneo.
El fibrinógeno es una glicoproteína dimérica, que contiene dos pares de cadenas peptídicas Aα, Bβ y cadenas y. Hay dos isoformas de este fibrinógeno, una con dos cadenas yA (yA/yA) y otra con una cadena yA y una cadena y' (yA,y'). Cuando el fibrinógeno es escindido por la trombina, libera el fibrinopéptido A o B. La trombina actúa sobre dos exositios del fibrinógeno. El exositio 1 media la unión de la trombina a las cadenas Aα y Bβ, y el exositio 2 provoca una interacción con una segunda molécula de fibrinógeno en el extremo C de la cadena y'. En consecuencia, cuando la trombina se une a un fibrinógeno yA/yA, solo el exositio 1 está ocupado, y cuando se une a yA/y', ambos exositios están unidos firmemente. Por lo tanto, el fibrinógeno yA/y' es un competidor del yA/yA, que disminuye la cantidad de coagulación. El yA/y' se une con un factor 20 veces mayor que el yA/yA. También existen inhibidores de la coagulación como la antitrombina y el cofactor II de la heparina, que evitan la coagulación cuando no es necesaria. Por el contrario, la batroxobina no es inhibida por la antitrombina y el cofactor II de la heparina. La batroxobina también tiene un alto valor de Kd para unirse a ambas formas yA/yA y yA/y'. Los sitios de unión de la batroxobina y la trombina se superponen parcialmente, pero hay algunas diferencias. La batroxobina unida a la fibrina conserva la actividad catalítica y es un estímulo más potente para la agregación de fibrina que la trombina unida a la fibrina. Esto probablemente se deba al carácter más lipofílico del exositio 1, que se une al fibrinógeno con mayor fuerza. El fibrinógeno es el único sustrato de la batroxobina, mientras que la trombina tiene múltiples sustratos. Esto probablemente se deba a la cavidad de unión al sodio que contiene la trombina.
Se han realizado estudios toxicocinéticos en varias especies animales, concretamente perros, ratones, cobayas, conejos, ratas y monos. La investigación se llevó a cabo mediante inmunoensayos para obtener los niveles plasmáticos y urinarios de batroxobina. También se midieron los niveles de fibrinógeno.
Normalmente el veneno es inyectado directamente en el torrente sanguíneo por la serpiente. En los experimentos realizados también se utilizó la inyección intravenosa de batroxobina. Se empleó una dosis total de 2 BU/kg (en perros también 0,2 BU/kg) administrada durante un tiempo de 30 minutos, tres veces al día. En el gráfico siguiente se pueden ver las concentraciones plasmáticas de batroxobina tras la administración.
Todas las especies mostraron un gran Vd (volumen de distribución). El valor del plasma en animales fue de alrededor de 50 ml/kg en promedio. En perros y monos el valor del Vd fue muy bajo en comparación con otras especies, es decir 1,5 veces el valor del plasma en otros animales. Por lo tanto, la batroxobina se distribuye principalmente a través de las venas y es absorbida poco por los tejidos. En las otras especies este valor fue aproximadamente cuatro veces mayor. Esto podría deberse a que la batroxobina es absorbida más fácilmente por el sistema reticuloendotelial en esas especies.
La batroxobina se excreta por el hígado, los riñones y el bazo. La excreción de batroxobina puede detectarse por pequeñas moléculas de metabolitos en la orina. Con el uso del inmunoensayo, solo se detectó entre el 0,2 y el 1,9% de la dosis en la orina. La cantidad de radiactividad de 125I-batroxobina fue del 69% en ratas y del 73% en perros en 48 horas. Por lo tanto, la batroxobina se excreta principalmente a través de los riñones en su forma degradada. Por lo tanto, no es detectable con un inmunoensayo.
Todas las especies respondieron de manera diferente a la exposición a la batroxobina. Esto significa que su capacidad para metabolizar esta proteasa no es la misma. Todas tienen sus propias vidas medias. Las vidas medias en perros son las más altas, 3,9 h y 5,8 h. En conejos y ratones, los valores de vida media fueron muy bajos, 0,3 h y 0,4 h respectivamente. Debido a que la batroxobina es una enzima, es degradada por una proteasa y escindida en partes no funcionales más pequeñas.
Una sobredosis de batroxobina puede provocar la muerte debido a sus efectos hemostáticos. Aún no se ha determinado una dosis letal o segura para humanos. La dosis segura para ratas es de 3,0 KU/kg [7] y para Macaca mulatta de 1,5 KU/kg. [8] La dosis letal solo se ha estudiado en ratones y es de 712,5548 ± 191,4479 KU/kg. [9]
La desfibrasa es el nombre comercial del fármaco batroxobin y se obtiene del veneno de Bothrops moojeni . Funciona como un agente desfibrinogenante y se utiliza en pacientes con trombosis. La batroxobina de la serpiente Bothrops atrox está patentada como Reptilase y se utiliza como fármaco hemostático.
