En enzimología , una limoneno-1,2-epóxido hidrolasa ( EC 3.3.2.8) es una enzima que cataliza la reacción química
Así, los dos sustratos de esta enzima son limoneno-1,2-epóxido y H 2 O , mientras que su producto es limoneno-1,2-diol.
Esta enzima se encuentra en la bacteria Rhodococcus erythropolis DCL14, donde desempeña un papel en la vía de degradación del limoneno que permite a la bacteria catabolizar el limoneno como fuente de carbono y energía. [1] La enzima pertenece a la familia de las hidrolasas , específicamente aquellas que actúan sobre enlaces éter (éter hidrolasas). El nombre sistemático de esta clase de enzimas es limoneno-1,2-epóxido hidrolasa . Esta enzima también se llama óxido de limoneno hidrolasa . Esta enzima tiene una actividad máxima a pH 7 y 50 ° C, [2] y participa en la degradación de limoneno y pineno . [ cita requerida ]
Las hidrolasas de epóxido catalizan la hidrólisis de epóxidos a dioles correspondientes , lo cual es importante en la desintoxicación , la síntesis de moléculas señal o el metabolismo . La hidrolasa de epóxido de limoneno-1,2- (LEH) difiere de muchas otras hidrolasas de epóxido (EH) en su estructura y su novedoso mecanismo catalítico de un solo paso . Las EH típicamente contienen pliegues de α/β-hidrolasa conservados y residuos catalíticos que ayudan con la estabilización del epóxido y su posterior reacción de hidrólisis. [3] Sin embargo, la baja masa molecular de la LEH de 16 kDa sugiere que es demasiado pequeña para albergar estos pliegues de α/β-hidrolasa y motivos de tríada catalítica encontrados en otras EH. Además, en comparación con otros EH, el LEH acepta una diversidad menor de sustratos y solo puede catalizar reacciones con limoneno-1,2-epóxido, óxido de 1-metilciclohexeno, óxido de ciclohexeno y óxido de indeno. Por lo tanto, el LEH se considera el miembro fundador de una nueva familia de EH, y sus detalles mecanísticos, estructurales y funcionales son de especial interés. [4]
La hidrólisis epóxica del limoneno catalizada por LEH ocurre en un mecanismo de un solo paso. El agua nucleófila ataca en una de las dos posiciones electrofílicas del epóxido, abriendo el anillo de tres miembros para crear dioles vecinales . [1] Estudios mecánico-cuánticos y mecánico-moleculares han observado que la hidrólisis mediada por LEH ataca preferentemente al carbono epóxico más sustituido. Las energías de activación del ataque en los carbonos más y menos sustituidos son 16,9 kcal/mol y 25,1 kcal/mol, respectivamente. [4] Estos datos también sugieren que el mecanismo LEH está catalizado por ácido, porque las condiciones ácidas favorecen la hidrólisis en el carbono epóxico más sustituido que tiene una mayor carga δ+ . [4]
El mecanismo de hidrólisis de LEH no utiliza un intermediario enzima-sustrato covalente , que es distinto de otros EH. [5] Sin embargo, todavía recluta aminoácidos del sitio activo para el intercambio de protones ácido-base y la estabilización del sustrato. Según estudios de mutagénesis , LEH contiene cinco residuos catalíticos cruciales : Asp101, Arg99, Asp132, Tyr53 y Asn55. Los primeros tres residuos catalíticos forman una tríada Asp-Arg-Asp que dona y acepta activamente protones de los sustratos en la reacción para impulsarla hacia adelante y ayudarla a proceder favorablemente. La evidencia del modelado computacional sugiere que Asp132 actúa para desprotonar el agua para aumentar su nucleofilicidad en la reacción, mientras que Asp101 protona el oxígeno del epóxido para formar uno de los dos alcoholes en el producto diol. Arg99 con carga positiva contribuye estabilizando las cargas negativas en Asp101 y Asp132. Los dos últimos residuos catalíticos, Tyr53 y Asn55, ayudan a estabilizar y unir la molécula de agua a través de enlaces de hidrógeno para ayudarla a lograr la orientación óptima para el ataque del epóxido. [1]
La reacción catalizada por LEH da como resultado una estereoquímica selectiva en sus carbonos quirales. LEH produce enantiómeros puros del limoneno-1,2-diol cuando se le da una mezcla racémica del epóxido. Cuando el sustrato tiene un centro quiral R en el carbono 4 ( 4R ), el producto es ( 1S,2S,4R )-limoneno-1,2-diol, independientemente de si el epóxido del sustrato es trans o cis con respecto a la sustitución en el carbono 4. De manera similar, un sustrato con un centro quiral S en el carbono 4 ( 4S ) produce solo el ( 1R,2R,4S )-limoneno-1,2-diol. [6] Debido a la naturaleza enantioconvergente de LEH y su capacidad para producir productos enantioméricos únicos, tiene aplicaciones significativas para la síntesis industrial. [7]
El LEH también tiene preferencia por estereoisómeros específicos de su sustrato. Reacciona con todos los epóxidos de limoneno ( 1R,2S ) antes de comenzar la hidrólisis de los estereoisómeros ( 1S,2R ). La presencia de sustratos ( 1S,2R ) no disminuye la velocidad de reacción con los estereoisómeros preferidos, lo que sugiere que los epóxidos de limoneno ( 1S,2R ) son inhibidores competitivos débiles . [8]
La estructura cristalina de LEH contiene una lámina beta mixta de seis cadenas , con tres hélices alfa N-terminales empaquetadas a un lado para crear un bolsillo que se extiende hacia el núcleo de la proteína . Una cuarta hélice se encuentra de tal manera que actúa como un borde para este bolsillo. Aunque principalmente revestido por residuos hidrófobos , este bolsillo presenta un grupo de grupos polares que se encuentran en su punto más profundo y constituyen el sitio activo de la enzima . [7] LEH también es un dímero con dos subunidades en un ángulo de 179° entre sí. Las dos subunidades son en gran parte simétricas, excluyendo los aminoácidos en el extremo N que están proximales al pliegue principal. [7]
Si bien la estructura de la LEH es distinta a la de la mayoría de las EH, no es completamente irreconocible en comparación con todas ellas. Por ejemplo, la epóxido hidrolasa Rv2740, nativa de Mycobacterium tuberculosis, contiene un sitio activo y una tríada catalítica similar a la LEH, con tres hélices empaquetadas en una lámina beta curva de seis hebras. [9] Al igual que la LEH, carece del pliegue α/β-hidrolasa que se encuentra en la mayoría de las EH. Con esta clase emergente de enzimas, la LEH y otras EH igualmente únicas pueden ser herramientas novedosas con un gran potencial para la catálisis industrial.
