La fosforribosilglicinamida formiltransferasa ( EC 2.1.2.2), también conocida como glicinamida ribonucleótido transformilasa ( GAR Tfase ), [1] es una enzima con nombre sistemático 10-formiltetrahidrofolato:5'-fosforribosilglicinamida N-formiltransferasa . [2] [3] [4] Esta enzima cataliza la siguiente reacción química.
Esta enzima dependiente de tetrahidrofolato (THF) cataliza una sustitución nucleofílica de acilo del grupo formilo de 10-formiltetrahidrofolato (fTHF) a N 1 -(5-fosfo-D-ribosil)glicinamida (GAR) para formar N 2 -formil-N 1 -(5-fosfo-D-ribosil)glicinamida (fGAR) como se muestra arriba. [5] Esta reacción juega un papel importante en la formación de purina a través de la vía de biosíntesis de purina de novo . Esta vía crea monofosfato de inosina (IMP), un precursor del monofosfato de adenosina (AMP) y el monofosfato de guanosina (GMP). El AMP es un componente básico para importantes portadores de energía como ATP, NAD + y FAD , y moléculas de señalización como cAMP . El papel de GARTfase en la biosíntesis de purina de novo lo convierte en un objetivo para los medicamentos contra el cáncer [6] y su sobreexpresión durante el desarrollo postnatal se ha relacionado con el síndrome de Down . [7] Hay dos tipos conocidos de genes que codifican GAR transformilasa en Escherichia coli : purN y purT, mientras que solo purN se encuentra en humanos. [8] Muchos residuos en el sitio activo se conservan en enzimas bacterianas, de levadura, aviares y humanas. [9]
En los seres humanos, la GARTfase forma parte de una enzima trifuncional que también incluye la glicinamida ribonucleótido sintasa ( GARS ) y la aminoimidazol ribonucleótido sintetasa ( AIRS ). Esta proteína (110 kDa) cataliza los pasos 2, 3 y 5 de la biosíntesis de purina de novo. La proximidad de estas unidades enzimáticas y la flexibilidad de la proteína sirven para aumentar el rendimiento de la vía. La GARTfase se encuentra en el extremo C-terminal de la proteína. [11]
La GARTfase humana ha sido cristalizada mediante el método de gota sentada con difusión de vapor y fotografiada en el Laboratorio de Radiación Sincrotrón de Stanford (SSRL) por al menos dos grupos. [1] [6]
La estructura se puede describir mediante dos subdominios que están conectados por una lámina beta de siete cadenas. El dominio N-terminal consiste en un pliegue mononucleotídico de tipo Rossman, con una parte de cuatro cadenas de la lámina beta rodeada a cada lado por dos hélices alfa. La lámina beta continúa en el dominio C-terminal, donde en un lado está cubierta por una hélice alfa larga y en el otro está parcialmente expuesta al solvente. Es la hendidura entre los dos subdominios donde se encuentra el sitio activo. [9]
La hendidura está formada por el sitio de unión de GAR y el bolsillo de unión de folato. El bolsillo de unión de folato está delineado por la hendidura de unión de pteridina, la región de transferencia de formilo y la región de benzoilglutamato que unen la cabeza de pteridina y una cola de benzoilglutamato conectadas por un nitrógeno de fTHF unido a formilo. Esta región de unión de folato ha sido objeto de mucha investigación porque su inhibición por moléculas pequeñas ha llevado al descubrimiento de fármacos antineoplásicos. Se ha demostrado que el bucle de unión de folato cambia de conformación dependiendo del pH de la solución y, como tal, la transformilasa GAR humana muestra su actividad más alta alrededor de pH 7,5-8. Las condiciones de pH más bajas (~4,2) también cambian la conformación de los bucles de unión del sustrato (GAR). [1]
Klein et al. fueron los primeros en sugerir un mecanismo asistido por moléculas de agua. Una única molécula de agua, posiblemente mantenida en su lugar por la unión de hidrógeno con el grupo carboxilato del residuo persistente Asp144, transfiere protones del GAR-N al THF-N. El nitrógeno nucleofílico del grupo amino terminal del GAR ataca al carbono carbonílico del grupo formilo del THF, lo que empuja la carga negativa hacia el oxígeno. Klein sugiere que la His108 estabiliza el estado de transición mediante la unión de hidrógeno con el oxígeno cargado negativamente y que la reformación del doble enlace carbonílico da como resultado la ruptura del enlace THF-N-formilo. Los cálculos de Qiao et al. sugieren que la transferencia escalonada de protones asistida por agua del Gar-N al THF-N es 80-100 kj/mol más favorable que la transferencia concertada sugerida por Klein. El mecanismo mostrado es sugerido por Qiao et al., quienes admitieron que no consideraron los residuos circundantes en sus cálculos. [12] [13] Gran parte del mapeo temprano del sitio activo en GAR TFase se determinó con la enzima bacteriana debido a la cantidad disponible a partir de su sobreexpresión en E. coli . [14] Utilizando un análogo de afinidad de dideazafolato de bromoacetilo, James Inglese y sus colegas identificaron por primera vez a Asp144 como un residuo del sitio activo probablemente involucrado en el mecanismo de transferencia de formilo. [15]
Los estudios de la variante purT de la transformilasa GAR en E. coli revelaron que la reacción se lleva a cabo a través de un intermediario de fosfato de formil. Si bien la reacción in vitro puede llevarse a cabo sin THF, en general la reacción in vivo es la misma. [16]
GART cataliza el tercer paso en la biosíntesis de purina de novo , la formación de N 2 -formil-N 1 -(5-fosfo-D-ribosil)glicinamida (fGAR) por adición de formilo a N 1 -(5-fosfo-D-ribosil)glicinamida (GAR). [4] En E. coli , la enzima purN es una proteína de 23 kDa [17] pero en humanos es parte de una proteína trifuncional de 110 kDa que incluye funcionalidades AIRS y GARS. [11] Esta proteína cataliza tres pasos diferentes de la vía de purina de novo .
Debido a su mayor tasa de crecimiento y a sus requerimientos metabólicos, las células cancerosas dependen de la biosíntesis de nucleótidos de novo para alcanzar los niveles de AMP y GMP necesarios. [18] La posibilidad de bloquear cualquiera de los pasos de la vía de purina de novo presentaría una reducción significativa en el crecimiento tumoral. Se han realizado estudios tanto sobre la unión del sustrato [19] como sobre el sitio de unión del folato [20] para encontrar inhibidores.
Se sospecha que la GARTfase está relacionada con el síndrome de Down. El gen que codifica la proteína trifuncional humana GARS-AIRS-GART se encuentra en el cromosoma 21q22.1, en la región crítica del síndrome de Down. La proteína se sobreexpresa en el cerebelo durante el desarrollo posnatal de los individuos con síndrome de Down. Por lo general, esta proteína es indetectable en el cerebelo poco después del nacimiento, pero se encuentra en niveles altos en el desarrollo prenatal. [7] [21]
