El etiquetado isobárico es una estrategia de espectrometría de masas utilizada en proteómica cuantitativa . Los péptidos o proteínas están marcados con grupos químicos que tienen (al menos nominalmente) una masa idéntica (isobárica), pero varían en términos de distribución de isótopos pesados en su estructura. Estas etiquetas, comúnmente denominadas etiquetas de masa en tándem, están diseñadas para que la etiqueta de masa se escinda en una región enlazadora específica mediante CID de alta energía (HCD) durante la espectrometría de masas en tándem, lo que produce iones indicadores de diferentes masas. Las etiquetas isobáricas más comunes son las etiquetas reactivas con aminas. [1] Sin embargo, también se han descrito etiquetas que reaccionan con residuos de cisteína y grupos carbonilo. [2] Estos grupos reactivos con amina pasan por reacciones de N-hidroxisuccinimida (NHS) , que se basan en tres tipos de grupos funcionales. [2] Los métodos de etiquetado isobárico incluyen etiquetas de masa en tándem (TMT) , etiquetas isobáricas para cuantificación relativa y absoluta (iTRAQ) , etiquetas diferenciales de masa para cuantificación absoluta y relativa, y etiquetado con dimetilo. [1] Los métodos TMT e iTRAQ son los más comunes y desarrollados de estos métodos. [1] Las etiquetas de masa en tándem tienen una región informadora de masa, una región enlazadora escindible, una región de normalización de masa y un grupo reactivo de proteína y tienen la misma masa total. [3]
(Yates, 2014) describe un flujo de trabajo típico de proteómica ascendente . [2] Las muestras de proteínas se digieren enzimáticamente mediante una proteasa para producir péptidos. Cada muestra experimental digerida se deriva de una variante isotópica diferente de la etiqueta de un conjunto. Las muestras se mezclan en proporciones normalmente iguales y se analizan simultáneamente en una ejecución de MS. Dado que las etiquetas son isobáricas y tienen propiedades químicas idénticas, las variantes isotópicas de las etiquetas aparecen como un único pico compuesto al mismo valor m/z en una exploración MS1 con tiempos de retención de cromatografía líquida (LC) idénticos. Durante el análisis de MS2 y tras la fragmentación, cada variante isotópica de la etiqueta produce iones de producto específicos de secuencia. Estos iones producto se utilizan para determinar la secuencia peptídica y las etiquetas informadoras cuyas abundancias reflejan la proporción relativa del péptido en las muestras que se combinaron. Se requiere el uso de MS/MS para detectar las etiquetas; por lo tanto, los péptidos no marcados no se cuantifican.
Explicado anteriormente por (Lee, Choe, Aggarwal, 2017). [4] Un beneficio clave del etiquetado isobárico sobre otras técnicas de cuantificación (por ejemplo, sin etiquetas) es la capacidad de multiplexación y, por tanto, el mayor potencial de rendimiento. La capacidad de combinar y analizar varias muestras simultáneamente en una ejecución de LC-MS elimina la necesidad de analizar múltiples conjuntos de datos y elimina la variación entre ejecuciones. La multiplexación reduce la variabilidad del procesamiento de muestras, mejora la especificidad al cuantificar los péptidos de cada condición simultáneamente y reduce el tiempo de respuesta para múltiples muestras. Sin multiplexación, se puede perder información de una ejecución a otra, lo que afecta la identificación y cuantificación, ya que los péptidos seleccionados para la fragmentación en una ejecución de LC-MS/MS pueden no estar presentes o en una cantidad adecuada en ejecuciones de muestras posteriores. Las etiquetas químicas isobáricas disponibles actualmente facilitan el análisis simultáneo de 2 a 11 muestras experimentales.
El etiquetado isobárico se ha utilizado con éxito para muchas aplicaciones biológicas, incluida la identificación y cuantificación de proteínas, el perfil de expresión de proteínas de estados normales frente a anormales, el análisis cuantitativo de proteínas para las que no hay anticuerpos disponibles y la identificación y cuantificación de proteínas modificadas postraduccionalmente. [4]
Hay dos tipos de etiquetas isobáricas disponibles comercialmente: etiquetas de masa en tándem (TMT) y etiquetas isobáricas para cuantificación relativa y absoluta (iTRAQ) . Los TMT reactivos con aminas están disponibles en juegos dúplex, 6-plex y 10-plex y ahora de 11-plex. [5] Los iTRAQ reactivos con aminas están disponibles en formas de 4 y 8 plex [6] .