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Etiqueta Halo

La región codificante de la proteína HaloTag se puede insertar cerca del gen de interés. También se inserta un gen de resistencia a la ampicilina con fines de purificación.

HaloTag es una etiqueta proteica autoetiquetante. Es una proteína de 297 residuos (33 kDa) derivada de una enzima bacteriana , diseñada para unirse covalentemente a un ligando sintético. La enzima bacteriana se puede fusionar a varias proteínas de interés. [1] El ligando sintético se elige entre una serie de ligandos disponibles de acuerdo con el tipo de experimentos que se van a realizar. Esta enzima bacteriana es una haloalcano deshalogenasa , que actúa como una hidrolasa y está diseñada para facilitar la visualización de la localización subcelular de una proteína de interés, la inmovilización de una proteína de interés o la captura de los socios de unión de una proteína de interés dentro de su entorno bioquímico. [2] El HaloTag está compuesto de dos segmentos unidos covalentemente que incluyen una haloalcano deshalogenasa y un ligando sintético de elección. Estos ligandos sintéticos consisten en un enlace de cloroalcano reactivo unido a un grupo funcional. [3] Los grupos funcionales pueden ser biotina (se puede utilizar como etiqueta de afinidad) o se pueden elegir entre cinco colorantes fluorescentes disponibles, entre ellos, cumarina, verde de Oregón, Alexa Fluor 488, diAcFAM y TMR. Estos colorantes fluorescentes se pueden utilizar para visualizar células vivas o fijadas químicamente. [4]

Mecanismo

Se encuentran disponibles cinco colorantes fluorescentes que pueden unirse al enlace reactivo. Además, se puede visualizar el cloro terminal del cloroalcano reactivo.

La HaloTag es una hidrolasa que tiene un sitio activo modificado genéticamente que se une específicamente al enlace reactivo de cloroalcano y tiene una mayor tasa de unión del ligando. [5] La reacción que forma el enlace entre la etiqueta de proteína y el enlace de cloroalcano es rápida y esencialmente irreversible en condiciones fisiológicas debido al cloro terminal de la porción del enlace. [6] En la reacción antes mencionada, el ataque nucleofílico del enlace reactivo de cloroalcano provoca el desplazamiento del halógeno con un residuo de aminoácido, lo que da como resultado la formación de un intermediario covalente de alquil-enzima. Este intermediario luego sería hidrolizado por un residuo de aminoácido dentro de la hidrolasa de tipo salvaje. [7] Esto conduciría a la regeneración de la enzima después de la reacción. Sin embargo, en la deshalogenasa de haloalcano modificada (HaloTag), el intermediario de reacción no puede proceder a una reacción posterior porque no puede hidrolizarse debido a la mutación en la enzima. Esto hace que el intermediario persista como un aducto covalente estable con el que no hay una reacción inversa asociada. [8]

Usos

Diferentes partes de la proteína de fusión. Como se ilustra en la figura, la proteína HaloTag consta del ligando sintético y de las partes de enlace de cloroalcano reactivo. La proteína HaloTag está unida a la proteína de interés.

Las proteínas de fusión HaloTagged se pueden expresar utilizando técnicas estándar de expresión de proteínas recombinantes . [9] Además, hay varios vectores comerciales disponibles que solo requieren la inserción de un gen de interés. [10] Dado que las deshalogenasas bacterianas son relativamente pequeñas y las reacciones descritas anteriormente son extrañas a las células de mamíferos, no hay interferencia por reacciones metabólicas endógenas de mamíferos. [11] Una vez que se ha expresado la proteína de fusión, existe una amplia gama de áreas potenciales de experimentación que incluyen ensayos enzimáticos, imágenes celulares, matrices de proteínas, determinación de la localización subcelular y muchas posibilidades adicionales. [12]

Recientemente, se ha diseñado HaloTag para crear biosensores híbridos de proteína + molécula pequeña de la actividad neuronal. [13] Estos sensores experimentan un cambio conformacional en respuesta a picos de concentración de calcio durante la activación neuronal; este cambio conformacional modula la conformación de una molécula de tinte unida a HaloTag. [13]

Véase también

Referencias

  1. ^ Los GV, Encell LP, McDougall MG, Hartzell DD, Karassina N, Zimprich C, et al. (junio de 2008). "HaloTag: una nueva tecnología de etiquetado de proteínas para la obtención de imágenes celulares y el análisis de proteínas". ACS Chemical Biology . 3 (6): 373–82. doi :10.1021/cb800025k. PMID  18533659.
  2. ^ Giepmans BN, Adams SR, Ellisman MH, Tsien RY (abril de 2006). "La caja de herramientas fluorescente para evaluar la ubicación y función de las proteínas". Science . 312 (5771): 217–24. Bibcode :2006Sci...312..217G. doi :10.1126/science.1124618. PMID  16614209. S2CID  1288600.
  3. ^ Kogure T, Karasawa S, Araki T, Saito K, Kinjo M, Miyawaki A (mayo de 2006). "Una variante fluorescente de una proteína del coral pétreo Montipora facilita la espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia de láser único de dos colores". Nature Biotechnology . 24 (5): 577–81. doi :10.1038/nbt1207. PMID  16648840. S2CID  19616823.
  4. ^ Miller LW, Cornish VW (febrero de 2005). "Etiquetado químico selectivo de proteínas en células vivas". Current Opinion in Chemical Biology . 9 (1): 56–61. doi :10.1016/j.cbpa.2004.12.007. PMID  15701454.
  5. ^ Pries F, Kingma J, Krooshof GH, Jeronimus-Stratingh CM, Bruins AP, Janssen DB (mayo de 1995). "La histidina 289 es esencial para la hidrólisis del intermediario alquilenzimático de la haloalcano deshalogenasa". The Journal of Biological Chemistry . 270 (18): 10405–11. doi : 10.1074/jbc.270.18.10405 . PMID  7737973.
  6. ^ Waugh DS (junio de 2005). "Aprovechar al máximo las etiquetas de afinidad". Tendencias en biotecnología . 23 (6): 316–20. doi :10.1016/j.tibtech.2005.03.012. PMID  15922084.
  7. ^ Chen I, Ting AY (febrero de 2005). "Etiquetado específico de sitio de proteínas con moléculas pequeñas en células vivas". Current Opinion in Biotechnology . 16 (1): 35–40. doi :10.1016/j.copbio.2004.12.003. PMID  15722013.
  8. ^ Marks KM, Nolan GP (agosto de 2006). "Estrategias de etiquetado químico para biología celular". Nature Methods . 3 (8): 591–6. doi :10.1038/nmeth906. PMID  16862131. S2CID  27848267.
  9. ^ Adams SR, Campbell RE, Gross LA, Martin BR, Walkup GK, Yao Y, et al. (mayo de 2002). "Nuevos ligandos biarsenicales y motivos de tetracisteína para el etiquetado de proteínas in vitro e in vivo: síntesis y aplicaciones biológicas". Journal of the American Chemical Society . 124 (21): 6063–76. doi :10.1021/ja017687n. PMID  12022841.
  10. ^ "Vectores HaloTag en Promega" . Consultado el 9 de febrero de 2017 .
  11. ^ Naested H, Fennema M, Hao L, Andersen M, Janssen DB, Mundy J (junio de 1999). "Un gen bacteriano de la haloalcano deshalogenasa como marcador de selección negativo en Arabidopsis" (PDF) . The Plant Journal . 18 (5): 571–6. doi :10.1046/j.1365-313x.1999.00477.x. hdl : 11370/3359ce65-5249-4057-bd7d-b22451ea5e85 . PMID:  10417708.
  12. ^ Janssen DB (abril de 2004). "Deshalogenasas de haloalcanos en evolución". Current Opinion in Chemical Biology . 8 (2): 150–9. doi :10.1016/j.cbpa.2004.02.012. PMID  15062775.
  13. ^ ab Deo, Claire; Abdelfattah, Ahmed S.; Bhargava, Hersh K.; Berro, Adam J.; Falcó, Natalie; Farrants, Helen; Moeyaert, Benjamien; Chupanova, Mariam; Lavis, Lucas D.; Schreiter, Eric R. (junio de 2021). "El HaloTag como armazón general para indicadores quimiogenéticos sintonizables del rojo lejano". Biología Química de la Naturaleza . 17 (6): 718–723. doi :10.1038/s41589-021-00775-w. ISSN  1552-4469. PMID  33795886. S2CID  232763093.