El ENU , también conocido como N -etil- N - nitrosourea (fórmula química C 3 H 7 N 3 O 2 ), es un mutágeno muy potente. Para un gen determinado en ratones , el ENU puede inducir 1 nueva mutación en cada 700 loci . También es tóxico en dosis altas.
El compuesto es un agente alquilante y actúa transfiriendo el grupo etilo del ENU a las nucleobases (normalmente timina ) de los ácidos nucleicos . Sus principales objetivos son las células madre espermatogoniales , de las que se derivan los espermatozoides maduros.
Bill Russell (1951) creó un hito en el campo de la genética del ratón al crear una cepa de ratón específicamente diseñada, la cepa T (test) que se utilizó en exámenes genéticos para probar mutágenos como radiaciones y productos químicos. El ratón T -stock alberga 7 mutaciones recesivas viables que afectan a rasgos fácilmente reconocibles. En el Laboratorio Nacional de Oak Ridge , el objetivo inicial de Russell era determinar la tasa de mutaciones genéticas heredables en la línea germinal inducidas por radiaciones. Por lo tanto, decidió utilizar ratones T -stock para definir la frecuencia con la que un conjunto de loci podía mutarse con radiaciones. Dado que las mutaciones en el ratón T -stock eran recesivas , la progenie tendría un fenotipo de tipo salvaje (como resultado de cruzar un mutante [p . ej., macho mutante s / s ] con una hembra de tipo salvaje [ + / + ]). Por lo tanto, con cualquier progenie que porte una mutación inducida por radiación en uno de los 7 loci, exhibiría el fenotipo mutante en la primera generación. Este enfoque, la prueba de locus específico (SLT), permitió a Russell estudiar una amplia gama de mutaciones específicas y calcular las tasas de mutación inducidas por las radiaciones. [3]
Además de estudiar el efecto de la radiación para la SLT, Russell et al. también estaban interesados en estudiar el efecto de mutágenos químicos como la procarbazina y la etilnitrosourea para la SLT. En ese momento, la procarbazina era el mutágeno químico más potente conocido que causaba una mutagénesis espermatogonial significativa en una SLT, aunque a una tasa un tercio de la de los rayos X. El trabajo de mutagénesis anterior de Russell en Drosophila utilizando dietilnitrosoamina (DEN) los impulsó a utilizar DEN para la SLT. Sin embargo, la DEN necesita ser convertida enzimáticamente en un agente alquilante para ser mutagénica y probablemente esta activación enzimática no fue suficiente en los mamíferos. Esto podría ilustrarse por la tasa de mutación extremadamente baja en ratones dada por DEN (3 en 60.179 crías). Para superar este problema, Ekkehart Vegel y Russell et al. propusieron utilizar un nuevo mutágeno, la N -etil- N -nitrosourea (ENU), un agente alquilante que no necesita ser metabolizado. Los ratones inducidos con ENU (250 mg/kg) pasaron por un período de esterilidad de 10 semanas. Después de la recuperación, se cruzaron 90 machos con hembras de la cepa T y se obtuvieron 7584 crías. [3] Sus resultados mostraron que una dosis de 250 mg/kg de ENU era capaz de producir una tasa de mutación 5 veces superior a la obtenida con 600R (1R = 2,6 x10^-4 culombios/kg) de irradiación aguda con rayos X. Esta tasa también fue 15 veces superior a la obtenida con procarbazina (600 mg/kg). [4]
Para superar el problema del período inicial de esterilidad, el grupo de Russell demostró que, en lugar de inyectar una dosis grande de ENU, una dosis fraccionada (100 mg/kg) [5] en un programa semanal permitía tolerar una dosis total más alta (300–400 mg/kg) [5] . Esto demostró además que la frecuencia de mutación mejoró hasta ser 12 veces mayor que la de los rayos X, 36 veces mayor que la de la procarbazina y más de 200 veces mayor que la de las mutaciones espontáneas. Cuando se promedió la tasa de mutación en los 7 loci, se descubrió que el ENU inducía mutaciones con una frecuencia de una por locus en cada 700 gametos. [3]
Desde que Russell et al. descubrieron que el ENU es el mutágeno más potente, se lo ha utilizado en pruebas genéticas directas (basadas en el fenotipo) con las que se puede identificar y estudiar un fenotipo de interés. Como se ilustra en la Figura 1, el proceso de prueba comienza con la mutagénesis de un ratón macho con ENU. A esto le sigue un análisis fenotípico sistemático de la progenie. Se evalúa a la progenie en busca de cambios conductuales, fisiológicos o dismorfológicos. Se identifica el fenotipo anormal. La identificación del gen candidato se logra luego mediante la clonación posicional de los ratones mutantes con el fenotipo de interés.
La ENU se utiliza como herramienta genética mediante el diseño de una variedad de pruebas genéticas adecuadas a los intereses de los investigadores. Según la región que se esté evaluando, las pruebas genéticas directas se pueden clasificar como se ilustra en la Figura 2 de la siguiente manera: [8]
Las regiones específicas se pueden clasificar de la siguiente manera:
La complementación es el fenómeno que permite la generación del fenotipo de tipo salvaje cuando se cruzan organismos portadores de mutaciones recesivas en diferentes genes. [8] Por lo tanto, si un organismo tiene una copia funcional del gen, esta copia funcional es capaz de complementar la copia mutada o perdida del gen. Por el contrario, si ambas copias del gen están mutadas o se pierden, esto conducirá a la no complementación alélica (Figura 3) y, por lo tanto, a la manifestación del fenotipo.
El fenómeno de la redundancia explica que a menudo varios genes son capaces de compensar la pérdida de un gen en particular. Sin embargo, si se pierden dos o más genes implicados en los mismos procesos o vías biológicas, esto conduce a una no complementación no alélica. En un cribado de no complementación, un macho inducido por ENU se cruza con una hembra portadora de un alelo mutante ( a ) del gen de interés (A). Si la mutación es dominante, estará presente en cada generación. Sin embargo, si la mutación es recesiva o si la progenie G 1 no es viable, se utiliza una estrategia diferente para identificar la mutación. Un macho tratado con ENU se cruza con una hembra de tipo salvaje. Del grupo de individuos G 1 , un macho heterocigoto se cruza con una hembra portadora del alelo mutante ( a ). Si la progenie G 2 es infértil o no viable, se puede recuperar de nuevo a partir del macho G 1 .
Las deleciones en los cromosomas pueden ser espontáneas o inducidas. En este estudio, los machos tratados con ENU se cruzan con hembras homocigotas para una deleción de la región de interés. La progenie G 1 son heterocigotas compuestas para la mutación inducida por ENU (Figura 4). Además, son haploides con respecto a los genes en la región eliminada y, por lo tanto, la pérdida de función o ganancia de función debido a la mutación inducida por ENU se expresa de manera dominante. Por lo tanto, los estudios de deleción tienen una ventaja sobre otros estudios recesivos debido a la identificación de la mutación en la propia progenie G 1 .
Rinchik et al . realizaron un análisis de deleción y complementación y pudieron aislar 11 loci recesivos independientes, que se agruparon en siete grupos de complementación en el cromosoma 7, una región que rodea el gen albino ( Tyr ) y el gen de dilución de ojos rosados ( p ). [8]
Un cromosoma que lleva una región balanceadora se denomina cromosoma balanceador . Un balanceador es una región que previene la recombinación entre cromosomas homólogos durante la meiosis. Esto es posible debido a la presencia de una región invertida o una serie de inversiones. El cromosoma balanceador se utilizó principalmente para estudios en genética de Drosophila melanogaster . Monica Justice et al. (2009) llevaron a cabo eficientemente una pantalla balanceadora usando un cromosoma balanceador construido por Allan Bradley et al. en el cromosoma 11 del ratón. En esta pantalla, un macho inducido por ENU se cruza con una hembra heterocigota para el cromosoma balanceador. [8] Los ratones que llevan el cromosoma balanceador tienen orejas y cola amarillas. Los heterocigotos G 1 (Figura 5) se cruzan con hembras que llevan la mutación rex ( Rex en la figura 5), que confiere un pelaje rizado. En G 2 , los homocigotos para el balanceador no son viables y no se recuperan. Los ratones que portan la mutación rex trans al balanceador o la mutación inducida por ENU tienen un pelaje rizado y son descartados. Los ratones mutantes ENU + mutantes rex son descartados para evitar la recombinación entre esos dos cromosomas durante el siguiente paso de reproducción, que genera mutantes homocigotos. Los ratones que son heterocigotos compuestos para el balanceador y la mutación inducida por ENU son apareados hermano-hermana para obtener homocigotos para la mutación inducida por ENU en G 3 .
Los análisis de todo el genoma suelen ser útiles para estudiar enfermedades genéticas en las que pueden estar implicadas múltiples vías genéticas y bioquímicas. Por tanto, con este enfoque se pueden identificar genes o regiones candidatos en todo el genoma que estén asociados con el fenotipo.
Estos análisis pueden diseñarse para identificar fenotipos recesivos y dominantes simples (Figura 6). Por lo tanto, un macho G 0 inducido por ENU se cruza con una hembra de tipo salvaje. La progenie G 1 puede analizarse para identificar mutaciones dominantes. Sin embargo, si la mutación es recesiva, los individuos G 3 homocigotos para la mutación pueden recuperarse de los machos G 1 de dos maneras:
Varias organizaciones de todo el mundo están realizando pruebas de mutagénesis de todo el genoma utilizando ENU. Algunas de ellas incluyen el Instituto de Genética Experimental del Centro Alemán de Investigación para la Salud Ambiental (GSF), Múnich, Alemania; el Laboratorio Jackson, Maine, EE. UU.; el Centro Australiano de Fenómica de la Universidad Nacional Australiana, Canberra, Australia; el Departamento de Neurobiología y Fisiología de la Universidad Northwestern, Illinois, EE. UU.; el Laboratorio Nacional Oak Ridge, Tennessee, EE. UU.; el Consejo de Investigación Médica (MRC) de Harwell, Oxfordshire, Reino Unido; el Departamento de Genética del Instituto de Investigación Scripps, California, EE. UU.; el Centro de Mutagénesis en Ratones para Defectos del Desarrollo del Colegio de Medicina de Baylor, Texas, EE. UU.; y otras. [6]
Un modificador como un potenciador o supresor puede alterar la función de un gen. En un cribado de modificadores, se selecciona un organismo con un fenotipo preexistente. Por lo tanto, cualquier mutación causada por el mutágeno (ENU) puede evaluarse para su actividad potenciadora o supresora. [8] El cribado de mutaciones dominantes y recesivas se realiza de forma similar al cribado convencional de todo el genoma (Figura 7). Se han realizado varios cribados de modificadores en Drosophila . Recientemente, Aliga et al. realizaron un cribado de modificadores dominantes utilizando ratones inducidos por ENU para identificar modificadores de la vía de señalización Notch. [9] Delta 1 es un ligando para el receptor Notch. Una pérdida de función homocigótica de Delta 1 ( Dll1 lacZ/lacZ ) es letal desde el punto de vista embrionario. Los ratones tratados con ENU se cruzaron con heterocigotos Dll1 lacZ . Se generaron 35 líneas mutantes en G 1 , de las cuales 7 revelaron modificadores de la vía de señalización Notch.
En el caso de enfermedades genéticas que involucran múltiples genes, las mutaciones en múltiples genes contribuyen a la progresión de una enfermedad. Sin embargo, la mutación en solo uno de estos genes podría no contribuir significativamente a ningún fenotipo. Estos "genes predisponentes" pueden identificarse utilizando pruebas de detección sensibilizadas. [10] En este tipo de prueba de detección, el trasfondo genético o ambiental se modifica para sensibilizar al ratón a estos cambios. La idea es que los genes predisponentes se puedan desentrañar en un trasfondo genético o ambiental modificado. Rinchik et al. realizaron una prueba de detección sensibilizada de ratones mutantes predispuestos a la nefropatía diabética. Los ratones fueron tratados con ENU en un trasfondo sensibilizado de diabetes tipo 1. Estos ratones diabéticos tenían una mutación Akita dominante en el gen de insulina-2 ( Ins2 Akita ). Estos ratones desarrollaron albuminuria, un fenotipo que no se observó en las crías no diabéticas. [11]
En términos generales, el ENU es bastante inestable, lo que hace que sea más fácil de inactivar cuando se utiliza como mutágeno experimental, en comparación con mutágenos moderadamente más estables como el EMS . El ENU cristalino puro es sensible a la luz y la humedad, por lo que debe almacenarse en condiciones frías y secas, y prepararse fresco en soluciones cuando sea necesario. [1] En soluciones acuosas, el ENU se degrada rápidamente a un pH básico, y los protocolos exigen la inactivación de soluciones de ENU con un volumen igual de 0,1 M KOH durante 24 horas, con o sin exposición a la luz ambiental para complementar la inactivación. [2]