El ensayo de nucleasa Surveyor es un ensayo de escisión de discrepancias enzimáticas que se utiliza para detectar discrepancias de bases únicas o pequeñas inserciones o eliminaciones ( indeles ).
La nucleasa Surveyor es parte de una familia de endonucleasas específicas de desajuste que se descubrieron en el apio (nucleasas CEL). [1] La enzima reconoce todas las sustituciones e inserciones/eliminaciones de bases, y escinde el lado 3' de los sitios no coincidentes en ambas cadenas de ADN con alta especificidad [2]
Este ensayo se ha utilizado para identificar y analizar mutaciones en una variedad de organismos y tipos de células, así como para confirmar modificaciones del genoma después de la edición del genoma (usando CRISPR / TALEN / dedos de zinc ).
La capacidad de descubrir y detectar mutaciones conocidas y desconocidas es de gran importancia en la investigación biomédica y el diagnóstico genético (ver Aplicaciones). Por lo tanto, se han desarrollado múltiples métodos para permitir la detección de tales mutaciones en el diagnóstico clínico y basada en la investigación.
La forma más directa de identificar los cambios/diferencias de secuencia es mediante la lectura de la secuencia de ADN con métodos de secuenciación de ADN tradicionales y de alto rendimiento (consulte Secuenciación de Sanger y Secuenciación de ADN ). Sin embargo, estos métodos proporcionan grandes cantidades de datos innecesarios y su uso es costoso. [3] Además, la secuenciación tradicional puede ser útil para la detección de mutaciones de la línea germinal, pero puede tener menos éxito en la detección de alelos somáticos menores a bajas frecuencias ( mosaicismo ). Por lo tanto, se requieren otros enfoques no basados en la secuenciación para detectar la mutación o los polimorfismos.
Otros métodos ampliamente utilizados dependen de las propiedades físicas del ADN, por ejemplo, sistemas basados en la temperatura de fusión, como el análisis de polimorfismo conformacional monocatenario (SSCP) y la cromatografía líquida desnaturalizante de alto rendimiento (DHPLC). Estas técnicas generalmente se limitan al análisis de fragmentos cortos de ADN (< 1000 pb) y solo pueden indicar la presencia de polimorfismo(s), pero no proporcionan fácilmente la ubicación de una mutación dentro de una secuencia de ADN. Por lo tanto, esto debe ir seguido de técnicas adicionales para identificar la mutación o mapear múltiples mutaciones en el mismo fragmento. [3]
Los ensayos de escisión enzimática de desajustes aprovechan las propiedades de las endonucleasas específicas de desajustes para detectar y escindir los desajustes. Estos métodos son fáciles de ejecutar utilizando técnicas y equipos de laboratorio estándar y pueden detectar polimorfismos, discrepancias de un solo par de bases e inserciones y eliminaciones a bajas frecuencias. [4] Se han descubierto varias de estas enzimas (incluidas CEL I, endonucleasa VII T4, endonucleasa V , endonucleasa I T7). [3]
Una de las enzimas comúnmente utilizadas es la nucleasa Surveyor (CEL II), que escinde el lado 3' de ambas cadenas de ADN con alta especificidad en los sitios de sustitución o inserción/deleción de bases. Esta enzima es capaz de escindir en múltiples mutaciones en grandes fragmentos de ADN y produce productos de escisión detectables a partir de ADN con errores de coincidencia que representan solo una pequeña proporción del ADN en una población, lo que la hace adecuada para su uso en ensayos de escisión de errores enzimáticos. [2]
En 1998, Olekowski et al. [5] identificaron una nueva endonucleasa específica de desajuste. La enzima se purificó del apio y recibió el nombre de CEL I.
Se demostró que CEL I corta el ADN con alta especificidad en ambas cadenas en el lado 3' de los desajustes de sustitución de bases y, por lo tanto, puede usarse en métodos de detección de mutaciones enzimáticas para identificar mutaciones y polimorfismos. Olekowski y sus colegas demostraron esta técnica utilizando esta enzima para detectar una variedad de mutaciones y polimorfismos en el gen BRCA1 humano. [1] [5] [6]
Mientras monitoreaban la purificación de CEL I usando electroforesis en gel de poliacrilamida , Yang et al. [1] notó que había dos bandas de nucleasas que permanecían juntas durante todos los pasos de purificación. La actividad nucleasa principal se denominó CEL I, mientras que la actividad menor en SDS-PAGE se denominó CEL II. Llegaron a la conclusión de que CEL I y CEL II son similares y que ambos son capaces de escindir un desajuste de ADN.
En 2004, Qiu et al. desarrolló una tecnología de detección de mutaciones basada en CEL II, también conocida como Surveyor Nuclease. [2] Desde entonces, el método se ha utilizado para detectar mutaciones y polimorfismos en muchos organismos y tipos de células diferentes (ver aplicaciones).
La nucleasa Surveyor obtuvo la licencia del Fox Chase Cancer Center de Transgenomic, Inc. y posteriormente se vendió a IDT , que actualmente la distribuye.
Inicialmente, el ADN de interés ( ADN nuclear o mitocondrial ) se extrae de tejidos o cultivos celulares. Esto se puede hacer mediante métodos de extracción estándar, como la digestión con proteinasa K seguida de precipitación con etanol o mediante otros métodos disponibles comercialmente.
Si se predice que el ADN será heterogéneo, por ejemplo, de un conjunto de células modificadas diferencialmente o de portadores de mutaciones heterocigotas, no es necesario agregar ADN de control.
La región de interés tanto en el ADN de referencia mutante como en el de tipo salvaje se amplifica mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La reacción de PCR debe llevarse a cabo utilizando una polimerasa correctora de alta fidelidad para evitar introducir errores de PCR que serán interpretados por la nucleasa. La reacción de PCR debe optimizarse para crear una banda de PCR única y fuerte, ya que las bandas no específicas aumentarán el ruido de fondo del ensayo.
Si se espera que el alelo de interés esté presente con baja frecuencia, como en el caso del mosaicismo somático o del ADN mitocondrial heteroplasmático, se podría considerar un protocolo de PCR modificado que enriquezca los alelos variantes a partir de una mezcla de ADN de tipo salvaje y que contiene mutaciones. (por ejemplo, PCR en FRÍO ).
El ADN de interés se desnaturaliza y se hibrida para formar heterodúplex que contienen una falta de coincidencia en el punto de la mutación, que luego puede identificarse mediante la nucleasa Surveyor. Si se predice que el ADN será homogéneo (por ejemplo, ADN mitocondrial homoplasmático o alelos idénticos en ambos cromosomas del ADN genómico), entonces se necesita ADN de una muestra de control para formar un heterodúplex que luego sea reconocible por la nucleasa. Si la muestra de ADN es heterogénea, no se necesita ADN de control adicional; sin embargo, los productos de la PCR aún deben desnaturalizarse y reasociarse para crear heterodúplex.
El ADN recocido se trata con nucleasa Surveyor para escindir los heterodúplex. Todos los tipos de discrepancias son identificables por la nucleasa Surveyor, aunque las preferencias de corte de discordancias se dividen en cuatro grupos, desde el más al menos preferido: CT, AC y CC se prefieren por igual a TT, seguidos por AA y GG, y finalmente seguidos por el menos preferido. , AG y GT. El contexto de la secuencia también influye en la tasa de digestión de la nucleasa Surveyor. [2]
Los productos de ADN digeridos se pueden analizar mediante electroforesis en gel convencional o electroforesis capilar de alta resolución. La detección de productos escindidos indica la presencia de un heterodúplex formado por una falta de coincidencia. La ubicación de la mutación/polimorfismo se puede inferir observando la longitud del fragmento después de la escisión. Si se utilizan cebadores marcados con fluorescencia para marcar los extremos 5' y 3' de los productos de PCR, se observarán bandas de diferentes colores en el análisis. El tamaño de cada banda confirma de forma independiente la posición de la mutación/polimorfismo. Se pueden detectar múltiples mutaciones por la presencia de varios fragmentos. [ 15]
Una de las principales ventajas de detectar mutaciones y polimorfismos utilizando métodos de nucleasas no coincidentes es que no se requieren conocimientos previos sobre la naturaleza de la mutación, a diferencia de otros métodos, como los polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) que se han utilizado para el análisis de SNP. en el pasado.
En comparación con los métodos basados en la temperatura de fusión, los métodos de endonucleasa específicos para desapareamientos no sólo son más rápidos, sino que también pueden detectar múltiples mutaciones en grandes fragmentos de ADN.
El método es factible de utilizar en sistemas de alto rendimiento que utilizan inyección automatizada, lo que lo hace adecuado para la detección. [7]
La nucleasa Surveyor es una enzima razonablemente sensible que produce productos de escisión detectables a partir de secuencias que representan sólo una pequeña proporción del ADN de la población. Puede detectar una proporción de heterodúplex a homodúplex de 1:32 para productos de PCR más pequeños (~0,6 kb) y de heterodúplex a homodúplex de 1:16 para productos de PCR más largos (~2,3 kb). Esta propiedad permite agrupar muestras clínicas para aumentar la formación de heterodúplex y, por tanto, la sensibilidad. [3] Esto también es útil para la detección de variantes menores en una población heterogénea (como un tumor heterogéneo). En el caso de la edición del genoma mediante CRISPR u otros métodos, esta propiedad puede mejorar la detección de eventos de edición raros en una población de células antes de la creación y prueba de clones editados individuales.
La nucleasa Surveyor escinde todos los tipos de desajustes, incluso si algunos son más preferidos que otros: CT, AC y CC se prefieren igualmente a TT, seguidos de AA y GG, y finalmente seguidos de los menos preferidos, AG y GT. También detecta Indels de hasta al menos 12 pb. [2]
El ensayo de nucleasa Surveyor también puede detectar múltiples mutaciones en el mismo fragmento. Sin embargo, esto requiere varios pasos de procesamiento adicionales que también pueden aumentar el fondo del ensayo (consulte Limitaciones).
Una de las principales limitaciones de este ensayo es que se basa en la amplificación por PCR y, por lo tanto, está influenciado por la calidad del producto amplificado. Los artefactos de la PCR (por ejemplo, dímeros de cebador o productos truncados) pueden aumentar el ruido de fondo y oscurecer la señal. Los cebadores-dímeros también pueden inhibir la actividad de la nucleasa topógrafo, reduciendo la señal.
Como el método de PCR tiene el potencial de introducir sus propias mutaciones durante la amplificación, estos errores también pueden aumentar el ruido de fondo. Por tanto, es mejor utilizar una polimerasa de alta fidelidad para minimizar los errores de amplificación.
El análisis del ADN mitocondrial podría ser susceptible a la contaminación por secuencias de ADN mitocondrial nuclear coamplificadas durante la reacción de PCR, lo que confunde el análisis del ADN mitocondrial homoplásmico versus heteroplásmico. [8]
Para detectar múltiples mutaciones en el mismo fragmento, se debe realizar una limpieza posterior a la PCR antes de la digestión con nucleasa Surveyor. La detección de múltiples desajustes también se puede mejorar aumentando el tiempo y la cantidad de nucleasa topográfica en la reacción, pero esto también aumenta el fondo debido a la escisión no específica.
La nucleasa Surveyor también tiene una actividad exonucleasa 5' que ataca los extremos del ADN bicatenario aumentando la señal de fondo durante la incubación prolongada. [2] Esto se puede reducir acortando el tiempo de digestión y agregando ADN polimerasa.
En los últimos años han surgido varias tecnologías de edición del genoma, incluidas las nucleasas con dedos de zinc (ZFN), las nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción ( TALEN ) y el sistema de nucleasa CRISPR/Cas9 guiado por ARN . Estos métodos promueven la edición del genoma mediante la introducción de una rotura de ADN de doble hebra, seguida de la reparación a través de las vías de unión de extremos no homólogos (NHEJ) o de reparación dirigida por homología (HDR). Si bien se espera que HDR introduzca una modificación consistente en el genoma, NHEJ puede introducir una mezcla heterogénea de mutaciones (generalmente pequeños indeles), que serán difíciles de identificar mediante la secuenciación de Sanger. Las mutaciones puntuales y los indeles se pueden detectar mediante el ensayo de nucleasa Surveyor, lo que lo hace útil para detectar la edición del genoma en un conjunto de células sin la necesidad de expansión clonal antes del análisis, y también puede proporcionar una estimación de la eficiencia de focalización lograda. [9] [10] [11] Incluso después de la expansión clonal, la detección de mutaciones utilizando la secuencia de Sanger puede ser difícil ya que cada alelo puede sufrir un evento de edición diferente. En este caso, el ensayo de nucleasa Surveyor en realidad utilizará este efecto para crear los heterodúplex necesarios para la detección mediante la endonucleasa no coincidente.
El ensayo de nucleasa Surveyor se ha utilizado para detectar mutaciones de la línea germinal en genes humanos. Por ejemplo, ATRX para el retraso mental ligado al cromosoma X, [12] y el gen HBB vinculado a la β-talasemia. [7] El ensayo también se ha utilizado para detectar mutaciones del ADN mitocondrial y nuclear asociadas con defectos de la cadena respiratoria, [13] y mutaciones asociadas con enfermedades renales. [14] [15]
El ensayo de nucleasa Surveyor se ha utilizado para detectar mutaciones somáticas en varios genes relacionados con el cáncer y, como se indicó anteriormente, se puede utilizar incluso cuando la muestra es heterogénea y el alelo mutante solo comprende entre el 1% y el 5% del total de alelos. [16] El método se ha utilizado para detectar mutaciones en el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), [16] [17] [18] [19] Janus Kinase 2 (JAK2), [20] [21] p53 [ 22] y otros.
El método se ha utilizado para detectar mutaciones que causan resistencia a los medicamentos en Mycobacterium tuberculosis . [23]