El sistema de un híbrido bacteriano (B1H) es un método para identificar el sitio diana específico de la secuencia de un dominio de unión al ADN . En este sistema, un factor de transcripción (TF) dado se expresa como una fusión a una subunidad de la ARN polimerasa . En paralelo, una biblioteca de oligonucleótidos aleatorios que representan secuencias diana potenciales del TF se clonan en un vector separado que contiene los genes seleccionables HIS3 y URA3 . Si el dominio de unión al ADN (cebo) se une a un sitio diana potencial del ADN (presa) in vivo , reclutará la ARN polimerasa al promotor y activará la transcripción de los genes reporteros en ese clon. Los dos genes reporteros, HIS3 y URA3, permiten selecciones positivas y negativas, respectivamente. Al final del proceso, los clones positivos se secuencian y examinan con herramientas de búsqueda de motivos para resolver la secuencia diana del ADN favorecida. [1]
En todos los organismos vivos, la regulación de la expresión génica está controlada por interacciones entre proteínas reguladoras de unión al ADN (factores de transcripción) y elementos reguladores cis , secuencias de ADN en o alrededor de los genes que actúan como sitios diana para las proteínas de unión al ADN. Al unirse a secuencias reguladoras cis y entre sí, los factores de transcripción afinan los niveles transcripcionales al estabilizar/desestabilizar la unión de la ARN polimerasa al promotor de un gen. Pero a pesar de su importancia y ubicuidad, se sabe poco sobre dónde exactamente se une cada una de estas proteínas reguladoras. La literatura sugiere que casi el 8% de los genes humanos codifican factores de transcripción y las funciones y especificidades de sus interacciones permanecen en gran parte inexploradas. [2] Estamos al borde de una convergencia de tecnologías de alto rendimiento y teoría genómica que está permitiendo a los investigadores comenzar a mapear estas interacciones a escala de todo el genoma. Solo recientemente se ha intentado un estudio completo de las especificidades de unión al ADN para una gran familia de dominios de unión al ADN. B1H es sólo una técnica emergente entre muchas que son útiles para estudiar las interacciones proteína-ADN. [3]
Se requiere la transformación de un huésped bacteriano con dos plásmidos diferentes . Uno está diseñado para expresar una proteína de interés que se une al ADN como una construcción de fusión con una subunidad de la ARN polimerasa (cebo). El otro plásmido contiene una región de secuencia aleatoria que representa sitios de unión potenciales (presa) que, si se une al producto de fusión quimérico, impulsa la expresión de genes reporteros posteriores. Esta región reportera facilita la selección positiva y negativa por parte de HIS3 y URA3, respectivamente, que en conjunto permiten el aislamiento de la presa que contiene la verdadera secuencia de ADN diana. HIS3 y URA3 codifican proteínas necesarias para la biosíntesis de histidina y uracilo.
El uso de un marcador de selección negativa es crucial para reducir en gran medida la incidencia de falsos positivos. Las presas autoactivantes, donde la región aleatoria facilita la expresión del reportero en ausencia de unión de TF, se eliminan transformando la biblioteca de vectores reporteros en bacterias en ausencia de cebo y ensayando el crecimiento en placas que contienen ácido 5-fluoro-orótico (5-FOA). El producto proteico de URA3 convierte el 5-FOA en un compuesto tóxico, lo que permite la supervivencia solo de aquellas colonias que contienen vectores reporteros que no son autoactivantes. La selección negativa normalmente precede a la selección positiva de modo que una biblioteca de presas más pequeña y purificada pueda ser sometida al proceso de selección positiva más riguroso. Tras la transformación de la biblioteca de presas purificada con el plásmido cebo, la selección positiva se logra cultivando la E. coli huésped en un medio mínimo carente de histidina (medio selectivo NM) que normalmente se complementa con concentraciones variables de 3-amino-triazol (3-AT), un inhibidor competitivo de HIS3. HIS3 codifica una proteína necesaria para la biosíntesis de histidina y, por lo tanto, solo las células que contienen combinaciones de cebo-presa que activan los genes reporteros podrán crecer. La manipulación de las concentraciones de 3-AT permite la caracterización de las rigurosidades de unión. De esta manera, los investigadores pueden medir la fuerza con la que el cebo se une a su presa (correlacionada con el nivel de expresión de HIS3) y, por lo tanto, determinar qué sitios de unión de nucleótidos tienen preferencias fuertes o débiles para una base dada. En otras palabras, si las células pueden crecer a pesar de una alta concentración de 3-AT, la unión cebo-presa debe ser de una rigurosidad lo suficientemente alta como para impulsar la expresión del gen reportero (HIS3) a un nivel suficiente para superar la inhibición competitiva resultante. Finalmente, los clones positivos se secuencian y se examinan con herramientas de búsqueda de motivos preexistentes (por ejemplo, MEME, BioProspector). [3]
El sistema de un híbrido de bacterias ha sufrido numerosas modificaciones desde su creación en 2005. [3] En última instancia, surgió como una variación del sistema de dos híbridos de bacterias, concebido en 2000, que a su vez se inspiró en los sistemas de uno y dos híbridos de levadura. [4] Mientras que las versiones de dos híbridos pueden evaluar tanto la interacción proteína-proteína como las interacciones proteína-ADN, el sistema de un híbrido se especializa en este último. El sistema B1H de Meng et al. difiere de la versión de dos híbridos en dos aspectos clave. Utiliza una biblioteca de presas aleatoria que consta de muchas secuencias objetivo potenciales únicas (<2x10 8 ) y también agrega un paso de selección negativa para purgar esta biblioteca de clones autoactivantes. [1] [3] Aunque estas ideas se tomaron prestadas del sistema original de un híbrido de levadura, [5] aún no se habían aplicado a un huésped bacteriano antes de 2005. A medida que la técnica se hizo más popular, los investigadores modificaron sus protocolos para mejorar el sistema B1H. Recientemente se ha favorecido el diseño del constructo de fusión (cebo) para la subunidad omega, en lugar de la alfa, de la ARN polimerasa con el fin de mejorar la estereoquímica y el rango dinámico de la quimera. [6] También se ha añadido un dominio de dedo de zinc en el constructo de fusión y su sitio de ADN diana correspondiente, adyacente a la secuencia de presa aleatoria, para aumentar la afinidad y la especificidad de las interacciones proteína-ADN. Esta mayor afinidad de unión general permite la caracterización incluso de aquellas proteínas del dominio de unión al ADN que interactúan débilmente con una secuencia diana. [7]
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El sistema B1H tiene ventajas significativas sobre otros métodos que investigan las interacciones proteína-ADN. La lectura basada en microarrays de inmunoprecipitación de cromatina ( ChIP-chip ) para la determinación de sitios de unión de alto rendimiento se basa en anticuerpos específicos que pueden no estar siempre disponibles. Los métodos que se basan en microarrays de unión de proteínas también requieren pasos adicionales de purificación de proteínas que no son necesarios en el sistema B1H. Además, estas técnicas basadas en microarrays a menudo son prohibitivas en términos de requerir instalaciones especiales y experiencia para analizar los datos resultantes. SELEX , otro sistema comúnmente utilizado para identificar los ácidos nucleicos objetivo para las proteínas de unión al ADN, requiere múltiples rondas de selección. Por el contrario, el sistema bacteriano de un solo híbrido requiere solo una ronda de selección in vitro y también ofrece una alternativa de baja tecnología a las tecnologías basadas en microarrays. No se requieren anticuerpos para estudiar las interacciones de las proteínas de unión al ADN en el sistema B1H. Una ventaja adicional es que el sistema B1H funciona no solo para proteínas monoméricas sino también para proteínas que se unen al ADN como complejos. El sistema B1H debe considerarse una técnica especializada para estudiar las interacciones proteína-ADN, mientras que las variantes de dos híbridos (B2H e Y2H ) pueden evaluar tanto las interacciones proteína-proteína como las interacciones proteína-ADN. Estos sistemas de dos híbridos son multipropósito, pero están limitados en términos de analizar solo una única biblioteca de “presa”. Una ventaja del sistema de un híbrido bacteriano sobre el sistema de un híbrido de levadura (Y1H) radica en la mayor eficiencia de transformación de plásmidos en bacterias, lo que permite examinar bibliotecas de “presa” más complejas. [1] [3]
A pesar de las ventajas mencionadas anteriormente como herramienta especializada, el sistema B1H tiene algunas desventajas. En primer lugar, el sistema de selección B1H tiene una capacidad limitada para determinar las especificidades de unión de los factores de transcripción con sitios de unión largos. Esto surge del hecho de que la cantidad de clones “presa” aleatorios necesarios para representar todas las posibles secuencias objetivo aumenta exponencialmente con la cantidad de nucleótidos en esa secuencia objetivo. En segundo lugar, algunos factores eucariotas pueden no expresarse o plegarse de manera eficiente en el sistema bacteriano, atribuido a diferentes redes reguladoras y maquinaria transcripcional. Por lo tanto, cuando se trabaja con proteínas de unión al ADN de origen eucariota, un sistema híbrido basado en levadura puede ser beneficioso. En tercer lugar, el sistema B1H puede no ser ideal para factores de transcripción que reconocen sitios de unión con baja afinidad. La lógica aquí es que la competencia creada por los sitios de unión en otras partes del genoma bacteriano puede limitar la señal que se puede obtener de un solo sitio de unión que está presente aguas arriba del reportero. [1] [3]
El sistema B1H proporciona una herramienta en nuestro arsenal para identificar las especificidades de unión al ADN de los factores de transcripción y, por lo tanto, predecir sus genes diana y los elementos reguladores del ADN genómico. También permite examinar los efectos de las interacciones proteína-proteína en la unión al ADN, lo que puede orientar aún más la predicción de módulos reguladores cis basados en la agrupación de sitios de unión. Además, el sistema de selección B1H tiene implicaciones para la predicción de funciones reguladoras de factores de transcripción no caracterizados previamente. [1]
Utilizando el sistema de un híbrido bacteriano, un estudio ha caracterizado 35 miembros de la red de segmentación de Drosophila melanogaster que incluye miembros representativos de todas las clases principales de proteínas de dominio de unión al ADN. [8] Las implicaciones para la investigación médica son evidentes a partir de otro estudio que utilizó el sistema B1H para identificar la especificidad de unión al ADN de un regulador transcripcional para un gen en Mycobacterium tuberculosis . [9] El sistema B1H también se ha utilizado para identificar un elemento de recambio importante en Escherichia coli. [10]
