DAPI (pronunciado 'DAPPY', /ˈdæpiː/), o 4′,6-diamidino-2-fenilindol , es un colorante fluorescente que se une fuertemente a las regiones ricas en adenina y timina del ADN . Se utiliza ampliamente en microscopía de fluorescencia . Como DAPI puede atravesar una membrana celular intacta , se puede utilizar para teñir tanto células vivas como fijadas , aunque atraviesa la membrana de manera menos eficiente en las células vivas y, por lo tanto, proporciona un marcador de viabilidad de la membrana.
El DAPI se sintetizó por primera vez en 1971 en el laboratorio de Otto Dann como parte de una búsqueda de fármacos para tratar la tripanosomiasis . Aunque no tuvo éxito como fármaco, investigaciones posteriores indicaron que se unía fuertemente al ADN y se volvía más fluorescente cuando se unía. Esto llevó a su uso para identificar ADN mitocondrial en ultracentrifugación en 1975, el primer uso registrado de DAPI como tinción fluorescente de ADN. [1]
La fuerte fluorescencia cuando se une al ADN condujo a la rápida adopción de DAPI para la tinción fluorescente del ADN para microscopía de fluorescencia . Su uso para detectar ADN en células de plantas , metazoos y bacterias y partículas de virus se demostró a fines de la década de 1970, y la tinción cuantitativa del ADN dentro de las células se demostró en 1977. El uso de DAPI como tinción de ADN para citometría de flujo también se demostró en esta época. [1]
Cuando se une al ADN bicatenario, el DAPI tiene un máximo de absorción a una longitud de onda de 358 nm ( ultravioleta ) y su máximo de emisión está a 461 nm (azul). Por lo tanto, para la microscopía de fluorescencia, el DAPI se excita con luz ultravioleta y se detecta a través de un filtro azul/cian. El pico de emisión es bastante amplio. [2] El DAPI también se unirá al ARN , aunque no es tan fluorescente. Su emisión se desplaza a alrededor de 500 nm cuando se une al ARN. [3] [4]
La emisión azul de DAPI es conveniente para los microscopistas que desean utilizar múltiples tinciones fluorescentes en una sola muestra. Existe cierta superposición de fluorescencia entre DAPI y moléculas fluorescentes verdes como la fluoresceína y la proteína fluorescente verde (GFP), pero el efecto de esto es pequeño. El uso de la desmezcla espectral puede explicar este efecto si se requiere un análisis de imágenes extremadamente preciso.
Además de la microscopía de luz de fluorescencia analítica, el DAPI también es popular para el etiquetado de cultivos celulares para detectar el ADN de micoplasma o virus contaminantes . Las partículas de micoplasma o virus etiquetadas en el medio de crecimiento emiten fluorescencia una vez teñidas con DAPI, lo que las hace fáciles de detectar. [5]
Esta sonda fluorescente de ADN se ha modelado de manera efectiva [6] utilizando la teoría funcional de la densidad dependiente del tiempo , acoplada con la versión IEF del modelo continuo polarizable . Este modelado mecánico cuántico ha racionalizado el comportamiento de absorción y fluorescencia dado por la unión y la intercalación del surco menor en el bolsillo del ADN, en términos de una flexibilidad estructural y polarización reducidas.
El DAPI se puede utilizar para la tinción de células fijas. La concentración de DAPI necesaria para la tinción de células vivas es generalmente muy alta; rara vez se utiliza para células vivas. [7] Está etiquetado como no tóxico en su MSDS [8] y aunque no se demostró que tenga mutagenicidad para E. coli , [9] está etiquetado como un mutágeno conocido en la información del fabricante. [2] Como es un compuesto de unión de ADN pequeño, es probable que tenga algunos efectos cancerígenos y se debe tener cuidado en su manipulación y eliminación.
Las tinciones de Hoechst son similares a DAPI en que también son tinciones de ADN fluorescentes azules que son compatibles con aplicaciones en células vivas y fijas, y son visibles utilizando las mismas configuraciones de filtro del equipo que para DAPI.
