La Eerste Divisie holandesa en la temporada 2000-01 fue disputada por 18 equipos. El FC Den Bosch ganó el campeonato.
Relegado de la Eredivisie 1999-2000
En la competición de ascenso/descenso participaron ocho participantes (seis de esta liga y dos de la Eredivisie) divididos en dos grupos. Los ganadores de grupo ascendieron a la Eredivisie.