stringtranslate.com

Difracción de electrones de microcristales

La difracción de electrones de microcristales , o MicroED , [1] [2] es un método CryoEM que fue desarrollado por el laboratorio Gonen a fines de 2013 en el Campus de Investigación Janelia del Instituto Médico Howard Hughes . MicroED es una forma de cristalografía electrónica donde se utilizan cristales delgados 3D para la determinación de la estructura por difracción de electrones . Antes de esta demostración, la cristalografía electrónica macromolecular (proteína) se usaba principalmente en cristales 2D, por ejemplo. [3] [4] El método es una de varias versiones modernas de enfoques para determinar estructuras atómicas utilizando difracción de electrones demostrada por primera vez para las posiciones de átomos de hidrógeno en cristales de NH4Cl por WE Laschkarew e ID Usykin en 1933, [5] que desde entonces se ha utilizado para superficies, [6] a través de difracción de electrones de precesión , [7] con gran parte del trabajo temprano descrito en el trabajo de Boris Vainshtein [8] y Douglas L. Dorset . [9]

El método fue desarrollado para la determinación de la estructura de proteínas a partir de nanocristales que normalmente no son adecuados para la difracción de rayos X debido a su tamaño. [10] Los cristales que son una milmillonésima parte del tamaño necesario para la cristalografía de rayos X pueden producir datos de alta calidad. [11] Las muestras se congelan hidratadas como para todas las demás modalidades de CryoEM, pero en lugar de utilizar el microscopio electrónico de transmisión ( TEM ) en modo de obtención de imágenes, se utiliza en modo de difracción con una baja exposición a electrones (normalmente < 0,01 e − /Å 2 /s). El nanocristal se expone al haz de difracción y se gira continuamente [2] mientras la difracción se recoge en una cámara rápida como una película. [2] Los datos de MicroED se procesan luego utilizando un software para cristalografía de rayos X para el análisis y refinamiento de la estructura. [12] El hardware y el software utilizados en un experimento de MicroED son estándar y están ampliamente disponibles. [13] [14]

Desarrollo

La difracción de electrones para resolver estructuras cristalinas se remonta a los primeros días de la difracción de electrones. La primera demostración exitosa de MicroED fue reportada en 2013 por el laboratorio Gonen [1] para la estructura de la lisozima , una proteína de prueba clásica en cristalografía de rayos X.

Configuración experimental

Se han publicado protocolos detallados para la configuración del microscopio electrónico y para la recopilación de datos. [15]

Instrumentación

Microscopio

Los datos de microED se recopilan mediante microscopía electrónica de transmisión (criogénica) . El microscopio puede estar equipado con una abertura de área seleccionada, pero la microED también se puede realizar sin una abertura de área seleccionada. Si bien se han informado algunas estructuras sin congelación, a veces se minimiza el daño por radiación y se obtiene una resolución más alta mediante el uso de enfriamiento criogénico incluso para moléculas pequeñas. [16]

Detectores

Se han utilizado diversos detectores para recopilar datos de difracción de electrones en experimentos de MicroED. Se han utilizado detectores que utilizan dispositivos de carga acoplada (CCD) y tecnología de semiconductores de óxido metálico complementario (CMOS) . Con los detectores CMOS, se pueden interpretar los recuentos de electrones individuales. [17] Más recientemente, se han utilizado con éxito detectores de electrones directos tanto en modo lineal como de recuento. [18] [19] En estos ejemplos, el recuento de electrones permitió la fase inicial y la visualización de hidrógenos en proteínas.

Recopilación de datos

Difracción fija

La publicación inicial de la prueba de concepto sobre MicroED utilizó cristales de lisozima. [1] Se recopilaron hasta 90 grados de datos de un solo nanocristal, con pasos discretos de 1 grado entre fotogramas. Cada patrón de difracción se recopiló con una tasa de dosis ultrabaja de ~0,01 e − /Å 2 /s. Los datos de 3 cristales se fusionaron [20] para producir una estructura con una resolución de 2,9 Å con buenas estadísticas de refinamiento, lo que permitió la determinación de la estructura de una proteína sensible a la dosis a partir de microcristales 3D en condiciones criogénicas.

Rotación continua

MicroED utiliza rotación continua durante el esquema de recolección de datos. [2] Aquí el cristal gira lentamente en una sola dirección mientras la difracción se registra en una cámara rápida como una película. Esto condujo a varias mejoras en la calidad de los datos y permitió el procesamiento de datos utilizando software cristalográfico de rayos X estándar. [2] La rotación continua de MicroED mejora el muestreo del espacio recíproco. [21]

Proceso de datos

Se han publicado protocolos detallados para el procesamiento de datos MicroED. [12] Cuando los datos MicroED se recopilan utilizando una rotación de etapa continua, se puede utilizar un software de cristalografía estándar [14] .

Diferencias entre MicroED y otros métodos de difracción de electrones

Otros métodos de difracción de electrones que se han desarrollado y demostrado que funcionan incluyen la tomografía de difracción automatizada (ADT) [22] y la difracción de electrones por rotación (RED [23] ). Estos métodos difieren ligeramente de la microED: en ADT, se utilizan pasos discretos de inclinación del goniómetro para cubrir el espacio recíproco en combinación con la precesión del haz para reducir los efectos de difracción dinámica. [22] ADT utiliza hardware y software para la precesión y la microscopía electrónica de transmisión de barrido para el seguimiento de cristales. [22] RED se realiza en TEM, pero el goniómetro se inclina en pasos discretos y se utiliza la inclinación del haz para rellenar los huecos. [23] Se utiliza software para procesar los datos de ADT y RED. [23]

Hitos

Alcance del método

La microED se ha utilizado para determinar las estructuras de proteínas globulares grandes, [24] proteínas pequeñas, [2] péptidos, [25] proteínas de membrana, [26] moléculas orgánicas, [27] [28] y compuestos inorgánicos. [29] En muchos de estos ejemplos se observaron hidrógenos e iones cargados. [25] [26]

Nuevas estructuras de la α-sinucleína en la enfermedad de Parkinson

Las primeras estructuras resueltas por MicroED se publicaron a finales de 2015. [25] Estas estructuras eran de fragmentos de péptidos que forman el núcleo tóxico de la α-sinculéína , la proteína responsable de la enfermedad de Parkinson y conducen a un conocimiento del mecanismo de agregación de los agregados tóxicos. Las estructuras se resolvieron con una resolución de 1,4 Å.

Nueva estructura proteica de R2lox

La primera estructura novedosa de una proteína resuelta mediante MicroED se publicó en 2019. [30] La proteína es la oxidasa de unión al ligando similar a la metaloenzima R2 (R2lox) de Sulfolobus acidocaldarius. La estructura se resolvió con una resolución de 3,0 Å mediante reemplazo molecular utilizando un modelo de identidad de secuencia del 35 % construido a partir del homólogo más cercano con una estructura conocida.

Referencias

  1. ^ abc Shi, Dan; Nannenga, Brent L; Iadanza, Matthew G; Gonen, Tamir (19 de noviembre de 2013). "Cristalografía electrónica tridimensional de microcristales de proteínas". eLife . 2 : e01345. doi : 10.7554/elife.01345 . ISSN  2050-084X. PMC  3831942 . PMID  24252878.
  2. ^ abcdef Nannenga, Brent L; Shi, Dan; Leslie, Andrew GW; Gonen, Tamir (3 de agosto de 2014). "Determinación de estructura de alta resolución mediante recopilación de datos de rotación continua en MicroED". Nature Methods . 11 (9): 927–930. doi :10.1038/nmeth.3043. ISSN  1548-7091. PMC 4149488 . PMID  25086503. 
  3. ^ Gonen, Tamir; Sliz, Piotr; Kistler, Joerg; Cheng, Yifan; Walz, Thomas (mayo de 2004). "Las uniones de membrana de la acuaporina-0 revelan la estructura de un poro de agua cerrado". Nature . 429 (6988): 193–197. doi :10.1038/nature02503. ISSN  1476-4687.
  4. ^ Walz, Thomas; Hirai, Teruhisa; Murata, Kazuyoshi; Heymann, J. Bernard; Mitsuoka, Kaoru; Fujiyoshi, Yoshinori; Smith, Bárbara L.; De acuerdo, Pedro; Engel, Andreas (junio de 1997). "La estructura tridimensional de la acuaporina-1". Naturaleza . 387 (6633): 624–627. doi :10.1038/42512. ISSN  0028-0836.
  5. ^ Laschkarew, NOSOTROS; Usyskin, ID (1933). "Die Bestimmung der Lage der Wasserstoffionen im NH4Cl-Kristallgitter durch Elektronenbeugung". Zeitschrift für Physik (en alemán). 85 (9–10): 618–630. doi :10.1007/BF01331003. ISSN  1434-6001.
  6. ^ Takayanagi, K.; Tanishiro, Y.; Takahashi, M.; Takahashi, S. (1 de mayo de 1985). "Análisis estructural de Si(111)-7×7 mediante difracción electrónica de transmisión UHV y microscopía". Journal of Vacuum Science & Technology A: Vacuum, Surfaces, and Films . 3 (3): 1502–1506. doi :10.1116/1.573160. ISSN  0734-2101.
  7. ^ Vincent, R.; Midgley, PA (1994). "Sistema de oscilación de haz cónico doble para la medición de intensidades de difracción de electrones integradas". Ultramicroscopía . 53 (3): 271–282. doi :10.1016/0304-3991(94)90039-6.
  8. ^ VAINSHTEIN, BK (1964), "Investigaciones experimentales de la estructura por difracción de electrones", Análisis de la estructura por difracción de electrones , Elsevier, págs. 295–390 , consultado el 1 de mayo de 2024
  9. ^ Dorset, DL (31 de agosto de 1995). Cristalografía electrónica estructural. Springer Science & Business Media. ISBN 978-0-306-45049-5.
  10. ^ Shi, Dan; Nannenga, Brent L; de la Cruz, M Jason; Liu, Jinyang; Sawtelle, Steven; Calero, Guillermo; Reyes, Francisco E; Hattne, Johan; Gonen, Tamir (mayo de 2016). "La recopilación de datos MicroED para cristalografía macromolecular". Protocolos de la Naturaleza . 11 (5): 895–904. doi :10.1038/nprot.2016.046. ISSN  1754-2189. PMC 5357465 . PMID  27077331. 
  11. ^ de la Cruz, M Jason; Hattne, Johan; Shi, Dan; Seidler, Paul; Rodriguez, Jose; Reyes, Francis E; Sawaya, Michael R; Cascio, Duilio; Weiss, Simon C (2017). "Estructuras de resolución atómica a partir de cristales de proteína fragmentados con el método cryoEM MicroED". Nature Methods . 14 (4): 399–402. doi :10.1038/nmeth.4178. ISSN  1548-7091. PMC 5376236 . PMID  28192420. 
  12. ^ ab Hattne, Johan; Reyes, Francisco E.; Nannenga, Brent L.; Shi, Dan; de la Cruz, M. Jason; Leslie, Andrew GW; Gonen, Tamir (1 de julio de 2015). "Recopilación y procesamiento de datos MicroED". Acta Crystallographica Sección A. 71 (4): 353–360. doi :10.1107/s2053273315010669. ISSN  2053-2733. PMC 4487423 . PMID  26131894. 
  13. ^ Zatsepin, Nadia A; Li, Chufeng; Colasurd, Paige; Nannenga, Brent L (octubre de 2019). "La complementariedad de la cristalografía serial de femtosegundos y MicroED para la determinación de la estructura a partir de microcristales". Current Opinion in Structural Biology . 58 : 286–293. doi :10.1016/j.sbi.2019.06.004. PMC 6778504 . PMID  31345629. 
  14. ^ ab Nannenga, Brent L.; Gonen, Tamir (mayo de 2019). "El método crio-EM de difracción de electrones de microcristales (MicroED)". Nature Methods . 16 (5): 369–379. doi :10.1038/s41592-019-0395-x. ISSN  1548-7091. PMC 6568260 . PMID  31040436. 
  15. ^ Shi, Dan; Nannenga, Brent L; de la Cruz, M Jason; Liu, Jinyang; Sawtelle, Steven; Calero, Guillermo; Reyes, Francisco E; Hattne, Johan; Gonen, Tamir (14 de abril de 2016). "La recopilación de datos MicroED para cristalografía macromolecular". Protocolos de la Naturaleza . 11 (5): 895–904. doi :10.1038/nprot.2016.046. ISSN  1754-2189. PMC 5357465 . PMID  27077331. 
  16. ^ Christensen, Jeppe; Horton, Peter N.; Bury, Charles S.; Dickerson, Joshua L.; Taberman, Helena; Garman, Elspeth F.; Coles, Simon J. (1 de julio de 2019). "Daños por radiación en cristalografía de moléculas pequeñas: hechos, no ficción". IUCrJ . 6 (4): 703–713. doi :10.1107/S2052252519006948. ISSN  2052-2525. PMC 6608633 . PMID  31316814. 
  17. ^ Consulte también https://www.gatan.com/ccd-vs-cmos y https://www.gatan.com/techniques/imaging.
  18. ^ Martynowycz, Michael W.; Clabbers, Max TB; Hattne, Johan; Gonen, Tamir (junio de 2022). "Estructuras macromoleculares en fase ab initio utilizando datos MicroED contados de electrones". Métodos de la naturaleza . 19 (6): 724–729. doi :10.1038/s41592-022-01485-4. ISSN  1548-7091. PMC 9184278 . PMID  35637302. 
  19. ^ Clabbers, Max TB; Martynowycz, Michael W.; Hattne, Johan; Gonen, Tamir (2022). "Hidrogenos y redes de enlaces de hidrógeno en datos macromoleculares MicroED". Revista de Biología Estructural: X . 6 : 100078. doi :10.1016/j.yjsbx.2022.100078. PMC 9731847 . PMID  36507068. 
  20. ^ Shi, Dan; Nannenga, Brent L; Iadanza, Matthew G; Gonen, Tamir (19 de noviembre de 2013). "Cristalografía electrónica tridimensional de microcristales de proteínas". eLife . 2 : e01345. doi : 10.7554/eLife.01345 . ISSN  2050-084X. PMC 3831942 . PMID  24252878. 
  21. ^ Nannenga, Brent L; Shi, Dan; Leslie, Andrew GW; Gonen, Tamir (septiembre de 2014). "Determinación de estructura de alta resolución mediante recopilación de datos de rotación continua en MicroED". Nature Methods . 11 (9): 927–930. doi :10.1038/nmeth.3043. ISSN  1548-7091. PMC 4149488 . PMID  25086503. 
  22. ^ abc Mugnaioli, E.; Gorelik, T.; Kolb, U. (2009). "Solución de estructura "ab initio" a partir de datos de difracción de electrones obtenidos mediante una combinación de tomografía de difracción automatizada y técnica de precesión". Ultramicroscopy . 109 (6): 758–765. doi :10.1016/j.ultramic.2009.01.011. ISSN  0304-3991. PMID  19269095.
  23. ^ abc Wan, Wei; Sun, Junliang; Su, Jie; Hovmöller, Sven; Zou, Xiaodong (15 de noviembre de 2013). "Difracción electrónica de rotación tridimensional: softwareRED para la recopilación y el procesamiento automatizados de datos". Journal of Applied Crystallography . 46 (6): 1863–1873. doi :10.1107/s0021889813027714. ISSN  0021-8898. PMC 3831301 . PMID  24282334. 
  24. ^ Nannenga, Brent L; Shi, Dan; Hattne, Johan; Reyes, Francis E; Gonen, Tamir (10 de octubre de 2014). "Estructura de la catalasa determinada por MicroED". eLife . 3 : e03600. doi : 10.7554/elife.03600 . ISSN  2050-084X. PMC 4359365 . PMID  25303172. 
  25. ^ abc Rodríguez, JA; Ivanova, M.; Sawaya, señor; Cascio, D.; Reyes, F.; Shi, D.; Johnson, L.; Günther, E.; Sangwan, S. (9 de septiembre de 2015). "Estructura MicroED del segmento, GVVHGVTTVA, del mutante familiar A53T de la proteína de la enfermedad de Parkinson, residuos de alfa-sinucleína 47-56". doi :10.2210/pdb4znn/pdb. {{cite journal}}: Requiere citar revista |journal=( ayuda )
  26. ^ ab Liu, S.; Gonen, T. (12 de septiembre de 2018). "La estructura microED del canal iónico NaK revela un proceso de partición de Na+ en el filtro de selectividad". doi :10.2210/pdb6cpv/pdb. S2CID  240183721. {{cite journal}}: Requiere citar revista |journal=( ayuda )
  27. ^ Gallagher-Jones, Marcus; Glynn, Calina; Boyer, David R.; Martynowycz, Michael W.; Hernandez, Evelyn; Miao, Jennifer; Zee, Chih-Te; Novikova, Irina V.; Goldschmidt, Lukasz (15 de enero de 2018). "La estructura crio-EM sub-ångström de una protofibrilla priónica revela un broche polar". Nature Structural & Molecular Biology . 25 (2): 131–134. doi :10.1038/s41594-017-0018-0. ISSN  1545-9993. PMC 6170007 . PMID  29335561. 
  28. ^ Jones, Christopher; Martynowycz, M; Hattne, Johan; Fulton, Tyler J.; Stoltz, Brian M.; Rodriguez, Jose A.; Nelson, Hosea; Gonen, Tamir (2018). "El método CryoEM MicroED como una herramienta poderosa para la determinación de la estructura de moléculas pequeñas" (PDF) . ACS Central Science . 4 (11): 1587–1592. doi :10.26434/chemrxiv.7215332.v1. PMC 6276044 . PMID  30555912. 
  29. ^ Vergara, Sandra; Lukes, Dylan A.; Martynowycz, Michael W.; Santiago, Ulises; Plascencia-Villa, Germán; Weiss, Simon C.; de la Cruz, M. Jason; Black, David M.; Alvarez, Marcos M. (31 de octubre de 2017). "La estructura microED de Au146(p-MBA)57 a resolución subatómica revela un grupo FCC gemelo". The Journal of Physical Chemistry Letters . 8 (22): 5523–5530. doi :10.1021/acs.jpclett.7b02621. ISSN  1948-7185. PMC 5769702 . PMID  29072840. 
  30. ^ Xu, Hongyi; Lebrette, Hugo; Clabbers, Max TB; Zhao, Jingjing; Griese, Julia J.; Zou, Xiaodong; Högbom, Martin (7 de agosto de 2019). "Resolución de una nueva estructura de proteína R2lox mediante difracción de electrones de microcristales". Science Advances . 5 (8): eaax4621. doi : 10.1126/sciadv.aax4621 . PMC 6685719 . PMID  31457106. 

Lectura adicional