Este artículo cubre la ingeniería de proteínas [1] de las enzimas del citocromo (CYP) P450 . Los P450 están involucrados en una variedad de procesos bioquímicos catabólicos y anabólicos . [2] Los P450 naturales pueden realizar varios tipos diferentes de reacciones químicas, incluyendo hidroxilaciones , N,O,S-desalquilaciones , epoxidaciones , sulfoxidaciones, acoplamientos arilo-arilo , contracciones y expansiones de anillo , ciclizaciones oxidativas, oxidaciones de alcohol/aldehído, desaturaciones , oxidaciones de nitrógeno, descarboxilaciones , nitraciones , así como deshalogenaciones oxidativas y reductoras . [2] [3] Los esfuerzos de ingeniería a menudo se esfuerzan por 1) mejorar la estabilidad 2) mejorar la actividad 3) mejorar el alcance del sustrato 4) permitir la capacidad de catalizar reacciones no naturales. [4] [5] La ingeniería de P450 es un campo emergente en las áreas de biología química y química orgánica sintética (quimioenzimática).
La ingeniería enzimática racional se caracteriza por realizar mutaciones específicas de aminoácidos basadas en información estructural o mecanística. Si bien las enzimas P450 se comprenden bien desde el punto de vista mecanístico, las mutaciones basadas en información estructural suelen estar limitadas por la dificultad de cristalización . [4] [5] Aunque, cuando se pueden obtener, el alto grado de flexibilidad y plasticidad del sitio activo presente en las P450 hace que las estructuras cristalinas queden en gran medida obsoletas para el diseño racional. [5] Otro problema se presenta cuando se intenta ampliar el alcance del sustrato. Esto a menudo se logra aumentando el tamaño del sitio activo de las P450 , lo que a su vez puede dar lugar a múltiples orientaciones de acoplamiento del sustrato , lo que da como resultado una regio-/estereoselectividad deficiente. [5]
La evolución dirigida es una estrategia de ingeniería enzimática diseñada para imitar la selección natural en un entorno de laboratorio. [2] [4] [5] Debido a la dificultad de implementar estrategias de diseño racionales, la evolución dirigida se ha convertido en la estrategia de elección para la ingeniería de P450. Aquí, las mutaciones se pueden introducir de forma semirracional o aleatoria mediante mutagénesis de saturación del sitio . Luego, el mutante P450 resultante (normalmente una biblioteca de mutantes) se examina para determinar la actividad deseada. [5] [6] [7] Los mutantes que muestran propiedades mejoradas se envían a rondas posteriores de mutagénesis, repitiendo este ciclo hasta que se cumpla adecuadamente la función deseada.
P450 BM3 (también conocido como CYP102A1) es una enzima del citocromo P450 aislada de Bacillus megaterium . [2] [4] [5] [6] [8] BM3 ha sido ampliamente estudiado en el contexto de la ingeniería enzimática debido a su solubilidad, isoformas bacterianas manejables y sistema de transporte de electrones autosuficiente, pero también debido a su utilidad sintética. [8] Los estudios de ingeniería han revelado que los mutantes BM3 pueden 1) estar dotados de nuevos y diferenciados alcances de sustrato 2) exhibir regio-/estereoselectividad en nuevos sustratos y 3) ser diseñados para ser altamente selectivos y activos hacia nuevos sustratos. [5] [6] [8] Las variantes de BM3 han sido particularmente útiles para producir fragancias , sabores , feromonas y productos farmacéuticos . [8] El ácido artemisínico (utilizado en la producción del producto farmacéutico natural artemisinina ) se produjo utilizando una variante BM3 responsable de epoxidar los dos alquenos presentes en la amorfa-4,11-dieno. [8] [9] La oxidación de valenceno a nootkatona (un apreciado sabor a pomelo) se logró utilizando un mutante F87T e I263A (Figura 1). [8]
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Recientemente, Wang et al. informaron una variante de BM3 capaz de realizar la ciclopropanación de olefinas de estirenilo . [6] Como el BM3 nativo muestra una actividad de ciclopropanación deficiente, se realizó un esfuerzo de ingeniería enzimática. En esencia, los P450 son enzimas hemo-tiolato que utilizan oxígeno molecular (O 2 ) y NAD(P)H para realizar reacciones de oxigenación. [10] Como tal, BM3 prefiere realizar epoxidación en lugar de reacciones de ciclopropanación en presencia de olefinas. [6] La reacción entre diazoacetato de etilo (EDA) y 1 se eligió como reacción modelo debido a la dificultad conocida de epoxidar olefinas deficientes en electrones utilizando catálisis de metales de transición (Figura 2). [6] Esta reacción genera el compuesto 2 , que se puede convertir fácilmente en levomilnacipran (Fetzima), un producto farmacéutico utilizado para tratar la depresión clínica . [6] Para comenzar, se generaron mutantes donde el residuo de cisteína coordinadora axial en el centro catalítico fue reemplazado con los aminoácidos serina, alanina, metionina, histidina y tirosina. El mutante T268A-axH, que tiene un ligando de histidina axial, catalizó la reacción entre EDA y 1 con un rendimiento del 81% con una diastereoselectividad de 6:94 y una enantioselectividad del 42%. [6] Luego se realizaron rondas posteriores de mutagénesis de saturación del sitio , que dieron como resultado la variante denominada BM3-Hstar (que contiene las mutaciones T268A-axH, L437W, V78M y L181V), que podría catalizar la reacción modelo con un rendimiento superior al 92%, una enantioselectividad del 92% y una diastereoselectividad de 2:98. [6] Como ventaja adicional, BM3-Hstar también fue capaz de realizar la reacción de ciclopropanación deseada en presencia de oxígeno atmosférico (O2) (la única variante conocida de BM3 capaz de esto). [6]
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Aparte de su utilidad sintética, las enzimas P450 también han sido diseñadas para comprender mejor su bioquímica. [10] Con base en el ciclo catalítico propuesto, una fracción de tiolato ligada axialmente (cisteína) dona densidad electrónica al centro metálico, ayudando en la protonación de un intermedio de anión férrico-peroxo ( −OO -Fe 3+ ) que tras la pérdida de agua genera una especie de hierro-oxo reactiva al enlace CH (O=Fe 4+ ). [2] [5] [8] [10] Alternativamente, si el anión férrico-peroxo permanece sin protonar, esta especie reactiva puede mediar la escisión del enlace CC en sustratos que contienen aldehído (desformilación). [10] Para comprender mejor la dicotomía intermedia entre el anión peroxo-férrico y la especie oxo-férrico, se diseñó el CYP125 (que es responsable de varios procesos metabólicos, incluida la degradación del colesterol) para reemplazar el residuo de cisteína ligado axialmente con selenocisteína (SeCYP125). A su vez, se observó que SeCYP125 favorece la formación de productos oxidados frente a productos deformilados cuando reacciona con colesterol-26-aldehído, lo que indica que una mayor donación de electrones de la selenocisteína en relación con la cisteína da como resultado una mayor proporción de oxo-férrico en relación con el anión peroxo-férrico (Figura 3). [10]
En 2016, el trabajo publicado por Dydio et al. informó sobre una metaloenzima artificial capaz de catalizar inserciones de CH de carbeno intra/intermoleculares en enlaces CH activados/desactivados, con una cinética como la de una enzima nativa (Figura 4). El catalizador informado se desarrolló cambiando el cofactor de hierro-protoporfirina en la enzima P450 termoestable CYP119A1 con un cofactor de iridio-metil -protoporfirina (Ir(Me)-PIX), seguido de una evolución dirigida. Posteriormente se obtuvo CYP119-Max, un mutante cuádruple (C317G, T213G, L69V, V254L). Se obtuvieron excesos enantioméricos (ee) de hasta ±98% con una carga de catalizador fija de 0,17 mol %. CYP119-Max también puede experimentar reacciones de inserción intermolecular, aunque con ee moderado (68%). Para demostrar la aplicabilidad de CYP119-Max en la producción de productos químicos finos, una reacción a escala de 200 mM produjo etil-2,3-dihidrobenzofuran-3-carboxilato con un rendimiento del 44 %, con un número de recambio (TON) de 35 000 y un 93 % de ee. [7]
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