Cyanidioschyzon merolae es una alga roja haploide unicelular, pequeña (2 μm), con forma de maza,adaptada a ambientes de aguas termales ácidas con alto contenido de azufre (pH 1,5, 45 °C). [2] [3] La arquitectura celular de C. merolae es extremadamente simple, contiene solo un único cloroplasto y una única mitocondria y carece de vacuola y pared celular . [4] Además, las divisiones celulares y de orgánulos pueden sincronizarse. Por estas razones, C. merolae se considera un excelente sistema modelo para el estudio de los procesos de división celular y de orgánulos, así como la bioquímica y la biología estructural . [5] [6] [7] El genoma del organismofue el primer genoma de alga completo en ser secuenciado en 2004; [8] Su plastidio fue secuenciado en 2000 y 2003, y su mitocondria en 1998. [9] El organismo ha sido considerado la más simple de las células eucariotas por su organización celular minimalista. [10]
Originalmente aislada por De Luca en 1978 de las fumarolas de solfatano de Campi Flegrei ( Nápoles, Italia ), [2] C. merolae se puede cultivar en cultivo en el laboratorio en medio de Allen modificado (MA) [7] o una forma modificada con el doble de concentración de algunos elementos llamada MA2. [10] [12] Usando medio MA, las tasas de crecimiento no son particularmente rápidas, con un tiempo de duplicación (el tiempo que tarda un cultivo de microbios en duplicar sus células por unidad de volumen) de aproximadamente 32 horas. [7] Usando el medio más óptimo MA2, esto se puede reducir a 24 horas. [7] El cultivo se realiza a 42 °C (108 °F) bajo luz fluorescente blanca con una intensidad aproximada de 50 μmol fotones m −2 s −1 (μE). [10] Sin embargo, bajo una intensidad de luz más alta de 90 μE con 5% de CO 2 aplicado a través de burbujeo, la tasa de crecimiento de C. merolae puede aumentar aún más, con un tiempo de duplicación de aproximadamente 9,2 horas. [7] Una luz más alta no es necesariamente beneficiosa, ya que por encima de 90 μE la tasa de crecimiento comienza a disminuir. [7] Esto puede deberse a un fotodaño que ocurre en el aparato fotosintético. C. merolae también se puede cultivar en placas de goma gellan para fines de selección de colonias o mantenimiento de cepas en el laboratorio. [7] C. merolae es un fotótrofo oxigénico obligado , lo que significa que no es capaz de absorber carbono fijado de su entorno y debe depender de la fotosíntesis oxigénica para fijar el carbono del CO 2 . [10]
El genoma de 16,5 pares de megabases de C. merolae fue secuenciado en 2004. [3] El genoma reducido, extremadamente simple y compacto está formado por 20 cromosomas y se encontró que contiene 5.331 genes, de los cuales el 86,3% se encontró que se expresaban y solo 26 contienen intrones , que contenían secuencias de consenso estrictas. [3] Sorprendentemente, el genoma de C. merolae contiene solo 30 genes de ARNt y un número extremadamente mínimo de copias de genes de ARN ribosómico , [3] como se muestra en la tabla de comparación de genomas. La naturaleza reducida del genoma ha dado lugar a varias otras características inusuales. Mientras que la mayoría de los eucariotas contienen alrededor de 10 copias de las dinaminas necesarias para pellizcar las membranas para separar los compartimentos divisores, C. merolae solo contiene dos, [3] un hecho que los investigadores han aprovechado al estudiar la división de orgánulos.
Aunque posee un genoma pequeño, [8] el genoma del cloroplasto de C. merolae contiene muchos genes que no están presentes en los genomas del cloroplasto de otras algas y plantas. [13] La mayoría de sus genes no tienen intrones. [8]
Como sucede con la mayoría de los organismos modelo, se han desarrollado herramientas genéticas en C. merolae . Estas incluyen métodos para el aislamiento de ADN y ARN de C. merolae , la introducción de ADN en C. merolae para una transformación transitoria o estable y métodos de selección que incluyen un auxótrofo de uracilo que puede usarse como marcador de selección.
Se utilizan varios métodos, derivados de protocolos cianobacterianos , para el aislamiento de ADN de C. merolae . [10] [14] El primero es una extracción con fenol caliente , que es una extracción rápida que se puede utilizar para aislar ADN adecuado para la reacción en cadena de la polimerasa de amplificación de ADN (PCR), [10] [15] en la que se añade fenol a células completas y se incuba a 65 °C para extraer ADN. [10] Si se requiere ADN más puro, se puede emplear el método de bromuro de cetil trimetil amonio (CTAB). En este método, primero se aplica un tampón de extracción con alto contenido de sal y se rompen las células, después de lo cual se utiliza una mezcla de cloroformo-fenol para extraer el ADN a temperatura ambiente. [10]
El ARN total se puede extraer de las células de C. merolae utilizando una variante del método de fenol caliente descrito anteriormente para el ADN. [10]
Al igual que en el caso del ADN y el ARN, el protocolo para la extracción de proteínas también es una adaptación del protocolo utilizado en las cianobacterias. [10] [16] Las células se rompen utilizando perlas de vidrio y agitando en un tampón de glicerol al 10 % que contiene el agente reductor DTT para romper los enlaces disulfuro dentro de las proteínas. [10] Esta extracción dará como resultado proteínas desnaturalizadas , que se pueden utilizar en geles SDS-PAGE para Western blotting y tinción con Coomassie .
C. merolae es sensible a muchos antibióticos que se usan comúnmente para la selección de individuos transformados con éxito en el laboratorio, pero es resistente a algunos, en particular a la ampicilina y la kanamicina . [7] [17]
Un marcador de selección comúnmente usado para la transformación en C. merolae involucra un auxótrofo de uracilo (que requiere uracilo exógeno). El mutante fue desarrollado cultivando C. merolae en presencia de un compuesto, 5-FOA, que en sí mismo no es tóxico pero se convierte en el compuesto tóxico 5-fluorouracilo por una enzima en la vía biosintética del uracilo, la orotidina 5'-monofosfato (OMP) descarboxilasa , codificada por el gen Ura5.3 . [7] La mutación aleatoria condujo a varios mutantes con pérdida de función en Ura5.3 , lo que permitió que las células sobrevivieran en presencia de 5-FOA siempre que se proporcionara uracilo. [7] Al transformar este mutante con un fragmento de PCR que lleva tanto un gen de interés como una copia funcional de Ura5.3 , los investigadores pueden confirmar que el gen de interés se ha incorporado al genoma de C. merolae si puede crecer sin uracilo exógeno.
Mientras que la integración cromosómica de genes crea un transformante estable, la expresión transitoria permite realizar experimentos a corto plazo utilizando genes marcados o modificados en C. merolae . La expresión transitoria se puede lograr utilizando un método basado en polietilenglicol (PEG) en protoplastos (células vegetales con la pared celular rígida eliminada enzimáticamente), y debido a que C. merolae carece de una pared celular, se comporta de manera muy similar a como lo haría un protoplasto para fines de transformación. [12] Para transformar, las células se exponen brevemente a PEG al 30% con el ADN de interés, lo que resulta en una transformación transitoria. [12] En este método, el ADN se toma como un elemento circular y no se integra en el genoma del organismo porque no existen regiones homólogas para la integración.
Para crear una línea mutante estable, se puede utilizar la selección de genes para insertar un gen de interés en una ubicación particular del genoma de C. merolae mediante recombinación homóloga . Al incluir regiones de ADN de varios cientos de pares de bases de longitud en los extremos del gen de interés que son complementarias a una secuencia dentro del genoma de C. merolae , se puede utilizar la propia maquinaria de reparación del ADN del organismo para insertar el gen en estas regiones. [18] Aquí se puede utilizar el mismo procedimiento de transformación que se utiliza para la expresión transitoria, excepto con los segmentos de ADN homólogos para permitir la integración del genoma. [18]
.jpg/1280px-C_merolae_EM_(Ursula_Goodenough).jpg)
El divisoma extremadamente simple, la arquitectura celular simple y la capacidad de sincronizar divisiones en C. merolae lo convierten en el organismo perfecto para estudiar los mecanismos de división de células y orgánulos eucariotas. [3] [6] La sincronización de la división de orgánulos en células cultivadas puede ser muy simple y generalmente implica el uso de ciclos de luz y oscuridad. El agente químico afidicolina se puede agregar para sincronizar de manera fácil y efectiva la división de cloroplastos. [19] El mecanismo de división de peroxisomas se determinó por primera vez utilizando C. merolae como sistema, [20] donde la división de peroxisomas se puede sincronizar utilizando el fármaco disruptor de microtúbulos orizalina además de ciclos de luz y oscuridad. [20]
C. merolae también se utiliza en la investigación de la fotosíntesis . Cabe destacar que la composición de subunidades de los fotosistemas en C. merolae tiene algunas diferencias significativas con respecto a la de otros organismos relacionados. [21] [22] El fotosistema II (PSII) de C. merolae , como podría esperarse, tiene un rango de pH particularmente inusual en el que puede funcionar. [21] [23] A pesar del hecho de que el mecanismo del PSII requiere que los protones se liberen rápidamente, y las soluciones de pH más bajo deberían alterar la capacidad para hacer esto, el PSII de C. merolae es capaz de intercambiar y dividir agua al mismo ritmo que otras especies relacionadas. [21]
Guiry, MD; Guiry, GM "Cyanidioschyzon merolae". AlgaeBase . Publicación electrónica mundial, Universidad Nacional de Irlanda, Galway.