En biología molecular , la cuantificación de ácidos nucleicos se realiza comúnmente para determinar las concentraciones promedio de ADN o ARN presentes en una mezcla, así como su pureza. Las reacciones que utilizan ácidos nucleicos a menudo requieren cantidades y pureza particulares para un rendimiento óptimo. Hasta la fecha, existen dos enfoques principales utilizados por los científicos para cuantificar o establecer la concentración de ácidos nucleicos (como ADN o ARN) en una solución. Estos son la cuantificación espectrofotométrica y el marcado con fluorescencia UV en presencia de un tinte de ADN. [ cita requerida ]
Una de las prácticas más utilizadas para cuantificar ADN o ARN es el uso de análisis espectrofotométrico mediante un espectrofotómetro . [1] Un espectrofotómetro es capaz de determinar las concentraciones promedio de los ácidos nucleicos ADN o ARN presentes en una mezcla, así como su pureza.
El análisis espectrofotométrico se basa en el principio de que los ácidos nucleicos absorben la luz ultravioleta siguiendo un patrón específico. En el caso del ADN y el ARN, se expone una muestra a la luz ultravioleta con una longitud de onda de 260 nanómetros (nm) y un fotodetector mide la luz que pasa a través de la muestra. Parte de la luz ultravioleta pasará a través de la muestra y parte será absorbida por el ADN o el ARN. Cuanto más luz absorba la muestra, mayor será la concentración de ácidos nucleicos en la muestra. El efecto resultante es que menos luz llegará al fotodetector y esto producirá una mayor densidad óptica (DO).
Utilizando la ley de Beer-Lambert es posible relacionar la cantidad de luz absorbida con la concentración de la molécula absorbente. A una longitud de onda de 260 nm, el coeficiente de extinción promedio para ADN bicatenario es 0,020 (μg/mL) −1 cm −1 , para ADN monocatenario es 0,027 (μg/mL) −1 cm −1 , para ARN monocatenario es 0,025 (μg/mL) −1 cm −1 y para oligonucleótidos monocatenarios cortos depende de la longitud y la composición de bases. Por lo tanto, una Absorbancia (A) de 1 corresponde a una concentración de 50 μg/mL para ADN bicatenario. Este método de cálculo es válido hasta una A de al menos 2. [2] Puede ser necesario un coeficiente de extinción más preciso para oligonucleótidos; Estos pueden predecirse utilizando el modelo del vecino más cercano. [3]
La densidad óptica [4] se genera a partir de la ecuación:
En términos prácticos, una muestra que no contiene ADN ni ARN no debería
absorber ninguna luz ultravioleta y, por lo tanto, producir una DO de 0.
Densidad óptica = Log (100/100) = 0
Cuando se utiliza el análisis espectrofotométrico para determinar la concentración de ADN o ARN, se utiliza la ley de Beer-Lambert para determinar concentraciones desconocidas sin necesidad de curvas estándar. En esencia, la ley de Beer-Lambert permite relacionar la cantidad de luz absorbida con la concentración de la molécula absorbente. Los siguientes factores de conversión de unidades de absorbancia a concentración de ácido nucleico se utilizan para convertir la DO en concentración de muestras de ácido nucleico desconocidas: [5]
Cuando se utiliza una longitud de trayectoria de 10 mm , simplemente se multiplica la DO por el factor de conversión para determinar la concentración. Por ejemplo, una muestra de dsADN con una DO de 2,0 corresponde a una muestra con una concentración de 100 μg/mL.
Al utilizar una longitud de trayectoria inferior a 10 mm, la DO resultante se reducirá en un factor de 10/longitud de trayectoria. Utilizando el ejemplo anterior con una longitud de trayectoria de 3 mm, la DO para la muestra de 100 μg/mL se reduciría a 0,6. Para normalizar la concentración a un equivalente de 10 mm, se hace lo siguiente:
0,6 DO X (10/3) * 50 μg/ml = 100 μg/ml
La mayoría de los espectrofotómetros permiten la selección del tipo de ácido nucleico y la longitud del recorrido de manera que la concentración resultante se normalice a la longitud del recorrido de 10 mm, que se basa en los principios de la ley de Beer .
La "unidad A260" se utiliza como medida de cantidad para los ácidos nucleicos. Una unidad A260 es la cantidad de ácido nucleico contenida en 1 ml y que produce una DO de 1. Se aplican los mismos factores de conversión y, por lo tanto, en dichos contextos:
Es común que las muestras de ácidos nucleicos estén contaminadas con otras moléculas (es decir, proteínas, compuestos orgánicos, otros). El beneficio secundario de usar análisis espectrofotométrico para la cuantificación de ácidos nucleicos es la capacidad de determinar la pureza de la muestra usando el cálculo de 260 nm:280 nm. La relación de la absorbancia a 260 y 280 nm (A 260/280 ) se utiliza para evaluar la pureza de los ácidos nucleicos. Para ADN puro, A 260/280 se considera ampliamente ~1.8 pero se ha argumentado que se traduce - debido a errores numéricos en el artículo original de Warburg - en una mezcla de 60% de proteína y 40% de ADN. [6] La relación para ARN puro A 260/280 es ~2.0. Estas relaciones se utilizan comúnmente para evaluar la cantidad de contaminación proteica que queda del proceso de aislamiento de ácidos nucleicos ya que las proteínas absorben a 280 nm.
La relación de absorbancia a 260 nm frente a 280 nm se utiliza comúnmente para evaluar la contaminación de ADN de soluciones de proteínas , ya que las proteínas (en particular, los aminoácidos aromáticos) absorben luz a 280 nm. [2] [7] Sin embargo, lo inverso no es cierto: se necesita una cantidad relativamente grande de contaminación proteica para afectar significativamente la relación 260:280 en una solución de ácido nucleico. [2] [6]
La relación 260:280 tiene una alta sensibilidad a la contaminación de ácidos nucleicos en proteínas:
La relación 260:280 carece de sensibilidad para la contaminación de proteínas en ácidos nucleicos (tabla mostrada para ARN, 100% ADN es aproximadamente 1,8):
Esta diferencia se debe a que los ácidos nucleicos tienen un coeficiente de atenuación de masa mucho mayor a 260 nm y 280 nm, en comparación con el de las proteínas. Debido a esto, incluso para concentraciones relativamente altas de proteína, la proteína contribuye relativamente poco a la absorbancia de 260 y 280. Si bien la contaminación proteica no se puede evaluar de manera confiable con una relación 260:280, esto también significa que contribuye poco al error en la estimación de la cantidad de ADN.
El examen de los espectros de la muestra puede ser útil para identificar si existe un problema con la pureza de la muestra.
Un método alternativo para evaluar la concentración de ADN y ARN es marcar la muestra con una etiqueta fluorescente , que es un tinte fluorescente utilizado para medir la intensidad de los tintes que se unen a los ácidos nucleicos y fluorescen selectivamente cuando se unen (por ejemplo , bromuro de etidio ). Este método es útil para los casos en los que la concentración es demasiado baja para evaluarla con precisión con espectrofotometría y en los casos en los que los contaminantes que absorben a 260 nm hacen imposible la cuantificación precisa por ese método. El beneficio de la cuantificación de fluorescencia de ADN y ARN es la sensibilidad mejorada sobre el análisis espectrofotométrico . Aunque, ese aumento en la sensibilidad tiene el costo de un mayor precio por muestra y un proceso de preparación de muestra más largo .
Existen dos formas principales de abordar esto. La "prueba de detección" implica colocar una muestra directamente sobre un gel de agarosa o una envoltura de plástico . El tinte fluorescente está presente en el gel de agarosa o se agrega en concentraciones apropiadas a las muestras en la película de plástico. Un conjunto de muestras con concentraciones conocidas se colocan junto a la muestra. Luego, se estima la concentración de la muestra desconocida mediante la comparación con la fluorescencia de estas concentraciones conocidas. Alternativamente, se puede pasar la muestra a través de un gel de agarosa o poliacrilamida , junto con algunas muestras de concentración conocida. Al igual que con la prueba de detección, la concentración se estima mediante la comparación de la intensidad fluorescente con las muestras conocidas. [2]
Si los volúmenes de muestra son lo suficientemente grandes como para utilizar microplacas o cubetas , las muestras cargadas con colorante también se pueden cuantificar con un fotómetro de fluorescencia . El volumen mínimo de muestra comienza en 0,3 μL. [10]
Hasta la fecha no existe ningún método de fluorescencia para determinar la contaminación proteica de una muestra de ADN que sea similar a la versión espectrofotométrica de 260 nm/280 nm.