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La agarosa es un heteropolisacárido , generalmente extraído de determinadas algas rojas . [1] Es un polímero lineal formado por la unidad repetitiva de agarobiosa, que es un disacárido formado por D -galactosa y 3,6-anhidro- L -galactopiranosa. [2] [3] La agarosa es uno de los dos componentes principales del agar y se purifica del agar eliminando el otro componente del agar, la agaropectina . [4]
La agarosa se utiliza frecuentemente en biología molecular para la separación de moléculas grandes, especialmente ADN , mediante electroforesis . Se preparan fácilmente placas de geles de agarosa (generalmente entre 0,7 y 2%) para electroforesis vertiendo la solución líquida tibia en un molde. Para este fin está disponible comercialmente una amplia gama de diferentes agarosas de diferentes pesos moleculares y propiedades. La agarosa también puede formarse en perlas y usarse en varios métodos cromatográficos para la purificación de proteínas .
La agarosa es un polímero lineal con un peso molecular de aproximadamente 120.000, que consta de D - galactosa y 3,6-anhidro - L -galactopiranosa alternadas unidas por enlaces glicosídicos α-(1→3) y β-(1→4). La 3,6-anhidro -L -galactopiranosa es una L -galactosa con un puente anhidro entre las posiciones 3 y 6, aunque algunas unidades de L -galactosa en el polímero pueden no contener el puente. Algunas unidades de D -galactosa y L -galactosa pueden estar metiladas , y también se encuentran piruvato y sulfato en pequeñas cantidades. [5]
Cada cadena de agarosa contiene aproximadamente 800 moléculas de galactosa y las cadenas de polímero de agarosa forman fibras helicoidales que se agregan en una estructura superenrollada con un radio de 20 a 30 nanómetros (nm). [6] Las fibras son casi rígidas y tienen una amplia gama de longitudes dependiendo de la concentración de agarosa. [7] Cuando se solidifican, las fibras forman una malla tridimensional de canales de diámetro que oscila entre 50 nm y >200 nm, dependiendo de la concentración de agarosa utilizada; concentraciones más altas producen diámetros de poro promedio más bajos. La estructura tridimensional se mantiene unida mediante enlaces de hidrógeno y, por lo tanto, puede romperse calentándola nuevamente a un estado líquido.
La agarosa está disponible como un polvo blanco que se disuelve en agua casi hirviendo y forma un gel cuando se enfría. La agarosa presenta el fenómeno de histéresis térmica en su transición de líquido a gel, es decir, gelifica y funde a diferentes temperaturas. Las temperaturas de gelificación y fusión varían según el tipo de agarosa. Las agarosas estándar derivadas de Gelidium tienen una temperatura de gelificación de 34 a 38 °C (93 a 100 °F) y una temperatura de fusión de 90 a 95 °C (194 a 203 °F), mientras que las derivadas de Gracilaria , debido a su mayor sustituyentes metoxi , tiene una temperatura de gelificación de 40 a 52 °C (104 a 126 °F) y una temperatura de fusión de 85 a 90 °C (185 a 194 °F). [8] Las temperaturas de fusión y gelificación pueden depender de la concentración del gel, particularmente a una concentración de gel baja de menos del 1%. Por tanto, las temperaturas de gelificación y fusión se dan para una concentración de agarosa especificada.
La agarosa natural contiene grupos metilo sin carga y el grado de metilación es directamente proporcional a la temperatura de gelificación. Sin embargo, la metilación sintética tiene el efecto inverso, por lo que una mayor metilación reduce la temperatura de gelificación. [9] Una variedad de agarosas modificadas químicamente con diferentes temperaturas de fusión y gelificación están disponibles mediante modificaciones químicas.
La agarosa en el gel forma una red que contiene poros y el tamaño de los poros depende de la concentración de agarosa añadida. Al reposar, los geles de agarosa son propensos a la sinéresis (extrusión de agua a través de la superficie del gel), pero el proceso es lo suficientemente lento como para no interferir con el uso del gel. [10] [11]
El gel de agarosa puede tener una alta resistencia del gel a baja concentración, lo que lo hace adecuado como medio anticonvección para la electroforesis en gel . Los geles de agarosa tan diluidos como al 0,15% pueden formar placas para electroforesis en gel. [12] El polímero de agarosa contiene grupos cargados, en particular piruvato y sulfato . [9] Estos grupos cargados negativamente pueden ralentizar el movimiento de las moléculas de ADN en un proceso llamado electroendosmosis (EEO) y, por lo tanto, generalmente se prefiere la agarosa con bajo EEO para su uso en la electroforesis de ácidos nucleicos en gel de agarosa . También se encuentran disponibles agarosas con EEO cero, pero pueden ser indeseables para algunas aplicaciones, ya que pueden prepararse agregando grupos cargados positivamente que pueden afectar las reacciones enzimáticas posteriores. [13] La electroendosmosis es una de las razones por las que la agarosa se usa preferentemente sobre el agar, ya que la agaropectina en el agar contiene una cantidad significativa de grupos sulfato y carboxilo cargados negativamente. La eliminación de agaropectina en agarosa reduce sustancialmente el EEO, además de reducir la adsorción no específica de biomoléculas a la matriz del gel. Sin embargo, para algunas aplicaciones, como la electroforesis de proteínas séricas, puede ser deseable un EEO elevado y se puede añadir agaropectina al gel utilizado. [14]
Las temperaturas de fusión y gelificación de la agarosa pueden modificarse mediante modificaciones químicas, más comúnmente mediante hidroxietilación, que reduce el número de enlaces de hidrógeno dentro de la cadena, lo que da como resultado temperaturas de fusión y fraguado más bajas en comparación con las agarosas estándar. [15] La temperatura exacta está determinada por el grado de sustitución, y muchas agarosas de bajo punto de fusión (LMP) disponibles pueden permanecer fluidas en un rango de 30 a 35 °C (86 a 95 °F). Esta propiedad permite que se lleven a cabo manipulaciones enzimáticas directamente después de la electroforesis en gel de ADN agregando rodajas de gel derretido que contienen fragmentos de ADN de interés a una mezcla de reacción. La agarosa LMP contiene menos sulfatos que pueden afectar algunas reacciones enzimáticas y, por lo tanto, se usa preferiblemente para algunas aplicaciones.
La agarosa hidroxietilada también tiene un tamaño de poro más pequeño (~90 nm) que las agarosas estándar. [16] La hidroxietilación puede reducir el tamaño de los poros al reducir la densidad de empaquetamiento de los haces de agarosa; por lo tanto, el gel LMP también puede tener un efecto sobre el tiempo y la separación durante la electroforesis. [17] Las agarosas con temperaturas de fusión o gelificación ultrabajas pueden gelificarse solo entre 8 y 15 °C (46 y 59 °F).
La agarosa es una matriz preferida para trabajar con proteínas y ácidos nucleicos , ya que tiene una amplia gama de estabilidad física, química y térmica, y su menor grado de complejidad química también hace que sea menos probable que interactúe con biomoléculas . La agarosa se utiliza más comúnmente como medio para la separación electroforética a escala analítica en la electroforesis en gel de agarosa . Los geles elaborados a partir de agarosa purificada tienen un tamaño de poro relativamente grande, lo que los hace útiles para la separación de moléculas grandes, como proteínas y complejos de proteínas >200 kilodaltons, así como fragmentos de ADN >100 pares de bases. La agarosa también se usa ampliamente para otras aplicaciones, por ejemplo , inmunodifusión e inmunoelectroforesis , ya que las fibras de agarosa pueden funcionar como ancla para inmunocomplejos .
La electroforesis en gel de agarosa es el método habitual para resolver el ADN en el laboratorio. Los geles de agarosa tienen un menor poder de resolución para el ADN que los geles de acrilamida , pero tienen un mayor rango de separación y, por lo tanto, generalmente se usan para fragmentos de ADN con longitudes de 50 a 20 000 pb ( pares de bases ), aunque es posible una resolución de más de 6 Mb con pulsos. Electroforesis en gel de campo (PFGE). [18] También se puede utilizar para separar moléculas de proteínas grandes y es la matriz preferida para la electroforesis en gel de partículas con radios efectivos superiores a 5-10 nm. [12]
El tamaño de los poros del gel afecta el tamaño del ADN que se puede tamizar. Cuanto menor sea la concentración del gel, mayor será el tamaño de los poros y mayor será el ADN que se puede tamizar. Sin embargo, los geles de baja concentración (0,1 - 0,2%) son frágiles y, por tanto, difíciles de manipular, y la electroforesis de moléculas grandes de ADN puede tardar varios días. El límite de resolución para la electroforesis en gel de agarosa estándar es de alrededor de 750 kb. [18] Este límite puede superarse mediante PFGE, donde se aplican campos eléctricos ortogonales alternos al gel. Los fragmentos de ADN se reorientan cuando el campo aplicado cambia de dirección, pero las moléculas de ADN más grandes tardan más en realinearse cuando se altera el campo eléctrico, mientras que las más pequeñas es más rápido, por lo que el ADN puede fraccionarse según su tamaño.
Los geles de agarosa se vierten en un molde y, una vez fraguados, generalmente se sumergen horizontalmente en una solución tampón. Los tampones Tris-acetato-EDTA y Tris-Borato-EDTA se utilizan habitualmente, pero en otras aplicaciones se pueden utilizar otros tampones como Tris-fosfato, ácido barbitúrico-barbitúrico de sodio o Tris- barbitúrico . [1] El ADN normalmente se visualiza tiñendo con bromuro de etidio y luego se observa bajo una luz ultravioleta , pero hay otros métodos de tinción disponibles, como SYBR Green , GelRed , azul de metileno y violeta cristal . Si los fragmentos de ADN separados se necesitan para experimentos posteriores, se pueden cortar del gel en rodajas para su posterior manipulación.
La matriz de gel de agarosa se utiliza a menudo para la purificación de proteínas , por ejemplo, en la separación a escala preparativa basada en columnas como en la cromatografía de filtración en gel , la cromatografía de afinidad y la cromatografía de intercambio iónico . Sin embargo, no se utiliza como un gel continuo, sino que se forma en perlas o resinas porosas de diferente finura. [19] Las perlas son muy porosas, por lo que la proteína puede fluir libremente a través de ellas. Estas perlas a base de agarosa son generalmente blandas y fáciles de triturar, por lo que deben usarse mediante procedimientos de flujo por gravedad, centrifugación a baja velocidad o baja presión. [20] La resistencia de las resinas se puede mejorar aumentando la reticulación y el endurecimiento químico de las resinas de agarosa; sin embargo, dichos cambios también pueden dar como resultado una menor capacidad de unión de proteínas en algunos procedimientos de separación, como la cromatografía de afinidad .
La agarosa es un material útil para la cromatografía porque no absorbe biomoléculas en un grado significativo, tiene buenas propiedades de flujo y puede tolerar pH y fuerza iónica extremos, así como altas concentraciones de desnaturalizantes como urea 8 M o guanidina HCl 6 M. [21] Ejemplos de matrices a base de agarosa para cromatografía de filtración en gel son Sepharose y WorkBeads 40 SEC (agarosa en perlas reticulada), Praesto y Superose (agarosas en perlas altamente entrecruzadas) y Superdex ( dextrano unido covalentemente a agarosa).
Para la cromatografía de afinidad, la agarosa en perlas es la resina de matriz más comúnmente utilizada para la unión de los ligandos que se unen a las proteínas. [22] Los ligandos están unidos covalentemente a través de un espaciador a grupos hidroxilo activados del polímero de perlas de agarosa. Luego, las proteínas de interés se pueden unir selectivamente a los ligandos para separarlas de otras proteínas, después de lo cual se pueden eluir. Las perlas de agarosa utilizadas suelen tener densidades del 4% y el 6% con una alta capacidad de unión a proteínas.
A veces se puede utilizar una placa de agarosa en lugar de agar para cultivar organismos, ya que el agar puede contener impurezas que pueden afectar el crecimiento del organismo o algunos procedimientos posteriores, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La agarosa también es más dura que el agar y, por lo tanto, puede ser preferible cuando se necesita una mayor resistencia del gel, y su temperatura de gelificación más baja puede evitar que se produzca un choque térmico en el organismo cuando las células se suspenden en líquido antes de gelificarse. Puede usarse para el cultivo de bacterias autótrofas estrictas, protoplastos vegetales , [23] Caenorhabditis elegans , [24] otros organismos y diversas líneas celulares.
A veces se utiliza agarosa en lugar de agar para medir la motilidad y movilidad de los microorganismos. Las especies móviles podrán migrar, aunque lentamente, a través del gel poroso y luego se podrán visualizar las tasas de infiltración. La porosidad del gel está directamente relacionada con la concentración de agar o agarosa en el medio, por lo que se pueden usar geles de diferentes concentraciones para evaluar la motilidad de natación , enjambre , deslizamiento y contracción de una célula. Se puede utilizar un ensayo de migración de células bajo agarosa para medir la quimiotaxis y la quimiocinesis. Se coloca una capa de gel de agarosa entre una población de células y un quimioatrayente . A medida que se desarrolla un gradiente de concentración a partir de la difusión del quimioatrayente en el gel, se pueden visualizar con el tiempo varias poblaciones de células que requieren diferentes niveles de estimulación para migrar mediante microfotografía a medida que hacen un túnel hacia arriba a través del gel contra la gravedad a lo largo del gradiente.