Cas12a ( proteína asociada a C RISPR 12a , anteriormente conocida como Cpf1 ) es un subtipo de proteínas Cas12 y una endonucleasa guiada por ARN que forma parte del sistema CRISPR en algunas bacterias y arqueas . Se origina como parte de un mecanismo inmunológico bacteriano , donde sirve para destruir el material genético de los virus y así proteger a la célula y colonia de la infección viral. Cas12a y otras endonucleasas asociadas a CRISPR utilizan un ARN (denominado crRNA en el caso de Cas12a) para apuntar al ácido nucleico en una materia específica y programable. En los organismos de los que se origina, este ARN guía es una copia de un fragmento de ácido nucleico extraño (es decir, un fago ) que infectó previamente la célula. [1]
Es de interés para los investigadores porque puede utilizarse para realizar modificaciones muy específicas del ADN o el ARN , similares al sistema más conocido CRISPR- Cas9 . [2] Cas12a se distingue de Cas9 por su único sitio activo de endonucleasa RuvC , su preferencia de motivo adyacente al protoespaciador 5' y por crear extremos pegajosos en lugar de romos en el sitio de corte. Estas y otras diferencias pueden hacerlo más adecuado en determinadas aplicaciones. Más allá de su uso en investigación básica , CRISPR-Cas12a podría tener aplicaciones en el tratamiento de enfermedades genéticas y en la implementación de impulsores genéticos . [2]
CRISPR-Cas12a se encontró buscando fragmentos de ADN prometedores en una base de datos publicada de secuencias genéticas bacterianas. Su identificación mediante bioinformática como proteína del sistema CRISPR, su denominación y un modelo oculto de Markov (HMM) para su detección se proporcionaron en 2012 en una publicación de la base de datos de familias de proteínas TIGRFAM . Cas12a aparece en muchas especies bacterianas. La endonucleasa Cas12a definitiva que se desarrolló como herramienta para la edición del genoma se tomó de una de las primeras 16 especies que se sabe que la albergan. [3] Dos enzimas candidatas de Acidaminococcus y Lachnospiraceae muestran una actividad eficiente de edición del genoma en células humanas. [2]
Una versión más pequeña de Cas9 de la bacteria Staphylococcus aureus es una posible alternativa a Cas12a. [3]
Los sistemas CRISPR-Cas se dividen en dos clases: la Clase 1 utiliza varias proteínas Cas junto con los ARN CRISPR (ARNcr) para construir una endonucleasa funcional, mientras que los sistemas CRISPR de Clase 2 utilizan solo una proteína Cas con un ARNcr. Según esta clasificación, Cas12a ha sido identificado como un sistema CRISPR-Cas de Clase II, Tipo V que contiene una proteína de 1300 aminoácidos. [4]
CRISPR ( repeticiones palindrómicas cortas agrupadas , regularmente interespaciadas ) recibe su nombre por las características de las secuencias de ADN invariantes involucradas en la focalización . Cas12a se conocía originalmente como Cpf1 como abreviatura de CRISPR y dos géneros de bacterias donde aparece, Prevotella y Francisella . Se le cambió el nombre en 2015 después de una racionalización más amplia de los nombres de las proteínas Cas ( asociadas a C RISPR ) para que correspondan a su homología de secuencia . [4]
El locus Cas12a contiene un dominio alfa / beta mixto , un RuvC-I seguido de una región helicoidal, un RuvC-II y un dominio similar a un dedo de zinc . [5] La proteína Cas12a tiene un dominio de endonucleasa similar a RuvC que es similar al dominio RuvC de Cas9. Además, Cas12a no tiene un dominio de endonucleasa HNH y el N-terminal de Cas12a no tiene el lóbulo de reconocimiento alfa-helicoidal de Cas9. [4]
La arquitectura del dominio Cas12a CRISPR-Cas muestra que Cas12a es funcionalmente único, clasificándose como sistema CRISPR Clase 2, tipo V. Los loci Cas12a codifican proteínas Cas1 , Cas2 y Cas4 más similares a los tipos I y III que a los sistemas de tipo II. Las búsquedas en bases de datos sugieren la abundancia de proteínas de la familia Cas12a en muchas especies bacterianas. [4]
El Cas12a funcional no necesita el ARNtracr , por lo tanto, solo se requiere ARNcr. Esto beneficia la edición del genoma porque Cas12a no solo es más pequeño que Cas9, sino que también tiene una molécula de sgRNA más pequeña (aproximadamente la mitad de nucleótidos que Cas9). [6]
El complejo Cas12a-crRNA escinde el ADN o ARN objetivo mediante la identificación de un motivo adyacente protoespaciador (PAM) 5'-YTN-3' [7] (donde "Y" es una pirimidina [8] y "N" es cualquier nucleobase ), en contraste con el PAM rico en G al que apunta Cas9. Después de la identificación de PAM, Cas12a introduce una rotura bicatenaria de ADN con un extremo adhesivo de 4 o 5 nucleótidos sobresalientes. [5]
El sistema CRISPR-Cas12a consta de una enzima Cas12a y un ARN guía que encuentra y posiciona el complejo en el lugar correcto de la doble hélice para escindir el ADN objetivo. La actividad de los sistemas CRISPR-Cas12a tiene tres etapas: [3]
Cas9 requiere dos moléculas de ARN para cortar el ADN, mientras que Cas12a necesita una. Las proteínas también cortan el ADN en diferentes lugares, lo que ofrece a los investigadores más opciones a la hora de seleccionar un sitio de edición. Cas9 corta ambas hebras de una molécula de ADN en la misma posición, dejando extremos romos . Cas12a deja una hebra más larga que la otra, creando puntas pegajosas . Los extremos adhesivos tienen propiedades diferentes a los extremos romos durante la unión de extremos no homólogos o la reparación homóloga del ADN, lo que confiere ciertas ventajas a Cas12a al intentar inserciones de genes, en comparación con Cas9. [3] Aunque el sistema CRISPR-Cas9 puede desactivar genes de manera eficiente, es un desafío insertar genes o generar una activación. [1] Cas12a carece de ARNtracr , utiliza un PAM rico en T y escinde el ADN mediante un DSB de ADN escalonado. [6]
En resumen, las diferencias importantes entre los sistemas Cas12a y Cas9 son que Cas12a: [10]
Las endonucleasas Cas12 probablemente evolucionaron en última instancia a partir de la endonucleasa TnpB de los transposones de la familia IS200/IS605. Los TnpB , que aún no están "domesticados" en el sistema inmunológico CRISPR, son capaces de realizar una escisión guiada por ARN utilizando un sistema de plantilla OmegaRNA . [11]
Múltiples aspectos influyen en la eficiencia y especificidad del objetivo cuando se utiliza CRISPR, incluido el diseño del ARN guía. Se han desarrollado muchos modelos de diseño y herramientas de software CRISPR-Cas para un diseño óptimo de ARN guía. Estos incluyen el diseñador SgRNA, CRISPR MultiTargeter, SSFinder. [12] Además, hay anticuerpos comerciales disponibles para detectar la proteína Cas12a. [13]
CRISPR-Cas9 está sujeto a disputas de propiedad intelectual , mientras que CRISPR-Cas12a no tiene los mismos problemas. [2]