KcsA (canal K de Streptomyces A) es un canal de potasio procariota de la bacteria del suelo Streptomyces lividans que se ha estudiado ampliamente en la investigación de canales iónicos . La proteína activada por pH posee dos segmentos transmembrana y una región de poro altamente selectiva, responsable de la activación y el transporte de iones K + fuera de la célula. [1] [2] La secuencia de aminoácidos que se encuentra en el filtro de selectividad de KcsA está altamente conservada entre los canales de voltaje K + procariotas y eucariotas ; [1] [3] como resultado, la investigación sobre KcsA ha proporcionado información estructural y mecanicista importante sobre la base molecular de la selección y conducción de iones K + . Como uno de los canales iónicos más estudiados hasta el día de hoy, KcsA es una plantilla para la investigación sobre la función del canal K + y su estructura dilucidada subyace al modelado computacional de la dinámica del canal tanto para especies procariotas como eucariotas. [4]
KcsA fue el primer canal de iones de potasio en ser caracterizado usando cristalografía de rayos X por Roderick MacKinnon y sus colegas en 1998. En los años previos a esto, la investigación sobre la estructura de los canales de K + se centró en el uso de la unión de toxinas pequeñas para revelar la ubicación del poro y el filtro de selectividad entre los residuos del canal. El grupo de MacKinnon teorizó la disposición tetramérica de los segmentos transmembrana , e incluso sugirió la presencia de “bucles” formadores de poros en la región del filtro hechos de segmentos cortos de aminoácidos que interactuaban con los iones K + que pasaban a través del canal [5] El descubrimiento de una fuerte homología de secuencia entre KcsA y otros canales de la familia Kv, incluida la proteína Shaker , atrajo la atención de la comunidad científica especialmente cuando la secuencia de firma del canal de K + comenzó a aparecer en otros genes procariotas . La simplicidad de las dos hélices transmembrana en KcsA, a diferencia de las seis en muchos canales iónicos eucariotas , también proporcionó un método para comprender los mecanismos de conducción de los canales de K + a un nivel más rudimentario, proporcionando así un gran impulso al estudio de KcsA.
La estructura cristalina de KcsA fue resuelta por el grupo MacKinnon en 1998 después del descubrimiento de que la eliminación del dominio citoplasmático del extremo C de la proteína nativa (residuos 126-158) aumenta la estabilidad de las muestras cristalizadas. Se produjo un modelo de KcsA con una resolución de 3,2 A que confirmó la disposición tetramérica de la proteína alrededor de un poro central, con una hélice de cada subunidad orientada hacia el eje interior y la otra hacia el exterior. [6] Tres años más tarde, Morais-Cabral y Zhou produjeron un modelo de mayor resolución después de que fragmentos Fab monoclonales se unieran a cristales de KcsA para estabilizar aún más el canal. [7] A principios de la década de 2000, surgió evidencia de la ocupación del filtro de selectividad por dos átomos de K + durante el proceso de transporte, basada en cálculos de energía y electrostática realizados para modelar la región del poro. La investigación continua de las diversas conformaciones abiertas y cerradas, inactivas y activas de KcsA mediante otros métodos de imágenes como ssNMR y EPR ha proporcionado desde entonces aún más conocimiento sobre la estructura del canal y las fuerzas que activan el cambio de la inactivación del canal a la conducción.
En 2007, Riek et al. demostraron que la apertura del canal que resulta de la titulación del canal iónico de pH 7 a pH 4, corresponde a cambios conformacionales en dos regiones: transición al estado de intercambio iónico del filtro de selectividad, y la apertura de la disposición de TM2 en el extremo C. [8] Este modelo explica la capacidad de KcsA para seleccionar simultáneamente iones K + mientras que también regula la conductancia eléctrica. En 2011, se resolvió la estructura cristalina de KcsA de longitud completa para revelar que el impedimento por los residuos previamente truncados permite solo una expansión directa de la región de paso de iones intercelulares de la proteína. Esta investigación proporciona una mirada más detallada al movimiento de regiones de canales separados durante la conducción iónica. [9] En la actualidad, los estudios de KcsA se centran en el uso del canal procariota como modelo para la dinámica del canal de canales de K + eucariotas más grandes , incluido hERG .
La estructura de KcsA es la de un cono invertido , con un poro central que corre por el centro formado por dos hélices transmembrana (la hélice externa M1 y la hélice interna M2), que abarcan la bicapa lipídica . El canal en sí es un tetrámero compuesto por cuatro subunidades idénticas de un solo dominio (cada una con dos hélices α) dispuestas de modo que una hélice M2 mira hacia el poro central, mientras que la otra hélice M1 mira hacia la membrana lipídica . Las hélices internas están inclinadas unos 25° en relación con la membrana lipídica y están ligeramente dobladas, abriéndose para mirar hacia el exterior de la célula como una flor. [6] Estas dos hélices TM están unidas por un bucle reentrante, dispersas simétricamente alrededor de un eje común correspondiente al poro central . La región porosa abarca aproximadamente 30 residuos de aminoácidos y se puede dividir en tres partes: un filtro de selectividad cerca del lado extracelular, una cavidad dilatada llena de agua en el centro y una compuerta cerrada cerca del lado citoplasmático formada por cuatro hélices M2 empaquetadas. [6] Se ha descubierto que esta arquitectura está altamente conservada en la familia de canales de potasio [10] [11] tanto en eucariotas como en procariotas.
La longitud total del poro es de 45 Å, y su diámetro varía considerablemente dentro de las distintas regiones del túnel interno. Viajando desde la región intracelular hacia afuera (de abajo hacia arriba en la imagen), el poro comienza con una región de compuerta formada por hélices M2 de 18 Å de diámetro, y luego se abre en una cavidad ancha (~10 Å de ancho) cerca del medio de la membrana. [6] En estas regiones, los iones K + están en contacto con las moléculas de agua circundantes, pero cuando ingresan al canal desde el filtro de selectividad en la parte superior, la cavidad es tan estrecha que los iones K + deben arrojar cualquier agua hidratante para poder ingresar a la célula. [6] Con respecto a la composición de aminoácidos de los residuos que recubren los poros dentro de KcsA, las cadenas laterales que recubren el poro interno y la cavidad son predominantemente hidrófobas , pero dentro del filtro de selectividad hay aminoácidos polares que entran en contacto con los iones K + deshidratados.
El extremo más ancho del cono corresponde a la boca extracelular del canal formado por hélices de poros, más un filtro de selectividad que está formado por una secuencia TVGYG , (Treonina, Valina, Glicina, Tirosina, Glicina), característica de los canales de potasio. [12] Dentro de esta región, la coordinación entre los aminoácidos TVGYG y los iones K + entrantes permite la conducción de iones a través del canal. El filtro de selectividad de KcsA contiene cuatro sitios de unión de iones, aunque se propone que solo dos de estas cuatro posiciones estén ocupadas a la vez. El filtro de selectividad tiene unos 3 Å de diámetro. [13] aunque las simulaciones de dinámica molecular sugieren que el filtro es flexible. [14] La presencia de TVGYG en la región del filtro de KcsA se conserva incluso en canales eucariotas más complejos, lo que convierte a KcsA en un sistema óptimo para estudiar la conductancia del canal de K + en diferentes especies.
El canal KcsA se considera un canal modelo porque la estructura de KcsA proporciona un marco para comprender la conducción del canal K + , que tiene tres partes: selectividad de potasio , activación del canal por sensibilidad al pH e inactivación del canal dependiente del voltaje. La permeación de iones K + ocurre en la región del filtro de selectividad superior del poro, mientras que la activación del pH aumenta a partir de la protonación de las hélices transmembrana en el extremo del poro. A pH bajo, la hélice M2 se protona, cambiando el canal iónico de conformación cerrada a abierta. [15] A medida que los iones fluyen a través del canal, se cree que los mecanismos de activación del voltaje inducen interacciones entre Glu71 y Asp80 en el filtro de selectividad, que desestabilizan la conformación conductora y facilitan la entrada a un estado no conductor de larga duración que se asemeja a la inactivación de tipo C de los canales dependientes del voltaje . [16]
En la conformación no conductora de KcsA a pH 7, K + está unido firmemente a los oxígenos de coordinación del filtro de selectividad y las cuatro hélices TM2 convergen cerca de la unión citoplasmática para bloquear el paso de cualquier ion potasio. [8] Sin embargo, a pH 4, KcsA experimenta intercambios conformacionales en una escala de tiempo de milisegundos entre los estados permeables y no permeables del filtro y entre las conformaciones abierta y cerrada de las hélices M2. [8] Si bien estos cambios conformacionales distintos ocurren en regiones separadas del canal, el comportamiento molecular de cada región está vinculado tanto por interacciones electrostáticas como por alosterio . [8] La dinámica de este intercambio de configuraciones estereoquímicas en el filtro proporciona la base física para la conductancia y la compuerta simultáneas de K + .
La secuencia TVGYG es especialmente importante para mantener la especificidad de potasio de KcsA. Las glicinas en esta secuencia de filtro de selectividad tienen ángulos diedros que permiten que los átomos de oxígeno del carbonilo en la estructura proteica del filtro apunten en una dirección, hacia los iones a lo largo del poro. [5] Las glicinas y la treonina se coordinan con el ion K + , mientras que las cadenas laterales de valina y tirosina se dirigen hacia el núcleo de la proteína para imponer una restricción geométrica en el filtro. Como resultado, el tetrámero de KcsA alberga cuatro sitios de unión de K + espaciados de manera uniforme , con cada lado compuesto por una jaula formada por ocho átomos de oxígeno que se encuentran en los vértices de un cubo. Los átomos de oxígeno que rodean a los iones K + en el filtro están dispuestos como las moléculas de agua que rodean a los iones K + hidratados en la cavidad del canal; esto sugiere que la coordinación del oxígeno y los sitios de unión en el filtro de selectividad están pagando el costo energético de la deshidratación de K + . [5] Debido a que el ion Na+ es demasiado pequeño para estos sitios de unión de tamaño K + , la energía de deshidratación no se compensa y, por lo tanto, el filtro selecciona otros iones extraños. [5] Además, el canal KcsA está bloqueado por iones Cs + y la activación requiere la presencia de iones Mg2 + . [1]
La conductancia dependiente del pH de KcsA indica que la apertura del canal iónico ocurre cuando la proteína se expone a un ambiente más ácido. Los estudios de RMN realizados por el grupo Riek muestran que la sensibilidad al pH ocurre tanto en la región C-terminal TM2 de la proteína como con los residuos Tyr78 y Gly79 en el filtro de selectividad. Hay evidencia que sugiere que el sensor principal de pH está en el dominio citoplasmático. El intercambio de aminoácidos cargados negativamente por neutros hizo que el canal KcsA fuera insensible al pH aunque no hubo cambios de aminoácidos en la región transmembrana. [17] [18] Además, entre el pH de 6 y 7, la histidina es una de las pocas cadenas laterales titulables de histidinas; están ausentes en los segmentos transmembrana y extracelular de TM2 pero presentes en el extremo C de KcsA. Esto resalta un posible mecanismo para la apertura lenta de KcsA, que es particularmente sensible al pH, especialmente porque la propagación conformacional de la señal de apertura del canal desde el extremo C hasta el filtro de selectividad podría ser importante para coordinar los cambios estructurales necesarios para la conductancia a lo largo de todo el poro.
Los estudios de RMN también sugieren que existe una red compleja de enlaces de hidrógeno entre Tyr78, Gly79, Glu71 y Asp80 en la región del filtro de KcsA, y que además actúa como un desencadenante sensible al pH para la conductancia. La mutación de residuos clave en la región, incluido E71A, da como resultado un gran costo de energía de 4 kcal mol −1 , equivalente a la pérdida del enlace de hidrógeno entre Glu71 y Tyr78 y el enlace de hidrógeno mediado por agua entre Glu71 y Asp80 en KcsA(E71A). Estos estudios resaltan aún más el papel de la activación del pH en la función del canal de KcsA.
En 2006, el grupo Perozo propuso una explicación mecanicista de los efectos de los campos de voltaje en la activación de KcsA. Después de añadir una corriente despolarizante al canal, se produce la reorientación de Glu71 hacia el poro intracelular, lo que altera el par carboxilo-carboxilato Glu71-Asp80 que inicialmente estabiliza el filtro de selectividad. El colapso de la región del filtro impide la entrada o facilita la salida del estado inactivado. [16] Glu71, una parte clave de la secuencia característica del filtro de selectividad que se conserva entre los canales iónicos K + , desempeña un papel fundamental en la activación, ya que su capacidad de reorientarse en la dirección del campo de voltaje transmembrana puede proporcionar una explicación de los eventos de activación de voltaje en KcsA. La orientación de los aminoácidos en la región del filtro podría desempeñar un papel fisiológico significativo en la modulación de los flujos de potasio en eucariotas y procariotas en condiciones de estado estable. [16]
El mecanismo preciso de la selectividad del canal de potasio continúa siendo estudiado y debatido y se utilizan múltiples modelos para describir diferentes aspectos de la selectividad. Los modelos que explican la selectividad basados en el concepto de intensidad de campo desarrollado por George Eisenman [19] basado en la ley de Coulomb se han aplicado a KcsA. [14] [20] Una explicación alternativa para la selectividad de KcsA se basa en el modelo de ajuste cercano (también conocido como el modelo de ajuste perfecto) desarrollado por Francisco Bezanilla y Armstrong . [21] Los átomos de oxígeno del carbonilo de la cadena principal que forman el filtro de selectividad se mantienen en una posición precisa que les permite sustituir a las moléculas de agua en la capa hidratada del ion potasio , pero están demasiado lejos de un ion sodio . Trabajos posteriores han estudiado las diferencias termodinámicas en la unión de iones, [22] consideraciones topológicas, [23] [24] y el número de sitios de unión de iones continuos. [25]
Además, aún queda por discutir una limitación importante del estudio y las simulaciones de la estructura cristalina: la estructura cristalina mejor resuelta y más aplicada de KcsA parece ser la de la forma "cerrada" del canal. Esto es razonable ya que el estado cerrado del canal se favorece a pH neutro , en el que la estructura cristalina se resolvió mediante cristalografía de rayos X. Sin embargo, el comportamiento dinámico de KcsA dificulta el análisis del canal ya que una estructura cristalina proporciona inevitablemente una imagen estática, promediada espacial y temporalmente de un canal. Para salvar la brecha entre la estructura molecular y el comportamiento fisiológico, se requiere una comprensión de la dinámica de resolución atómica de los canales de potasio.
Debido a la alta similitud de secuencia entre el poro de KcsA y otras proteínas eucariotas del canal iónico K + , KcsA ha proporcionado información importante sobre el comportamiento de otras proteínas importantes conductoras de voltaje como el Shaker derivado de drosophilla y el canal de potasio hERG humano . KcsA se ha utilizado en estudios de mutagénesis para modelar las interacciones entre hERG y varios compuestos farmacológicos. Dichas pruebas pueden detectar interacciones fármaco-canal hERG que causan el síndrome de QT largo adquirido , son esenciales para determinar la seguridad cardíaca de nuevos medicamentos. [26] Además, se han generado computacionalmente modelos de homología basados en la estructura cristalina de estado cerrado de KcsA para construir una representación de estado múltiple del canal de K + cardíaco hERG . Dichos modelos revelan la flexibilidad del canal hERG y pueden predecir consistentemente la afinidad de unión de un conjunto de diversos ligandos que interactúan con el canal iónico. El análisis de las estructuras complejas de ligando-hERG se puede utilizar para guiar la síntesis de análogos de fármacos con menor capacidad de hERG, en función de la estructura del fármaco y el potencial de acoplamiento. [27]