La aminoglucósido-3'-fosfotransferasa (APH(3')), también conocida como aminoglucósido quinasa , es una enzima que cataliza principalmente la adición de fosfato de ATP al grupo hidroxilo 3' de un aminoglucósido disustituido en 4,6 , como la kanamicina . [2] Sin embargo, también se ha descubierto que la APH(3') fosforila en el grupo hidroxilo 5' en aminoglucósidos disustituidos en 4,5, que carecen de un grupo hidroxilo 3', y difosforila grupos hidroxilo en aminoglucósidos que tienen grupos hidroxilo 3' y 5'. [2] [3] Principalmente cargados positivamente en condiciones biológicas, los aminoglucósidos se unen a la cadena principal cargada negativamente de los ácidos nucleicos para interrumpir la síntesis de proteínas , inhibiendo eficazmente el crecimiento de células bacterianas. [4] La fosforilación de aminoglucósidos mediada por APH(3') altera eficazmente su mecanismo de acción, introduciendo un grupo fosfato que reduce su afinidad de unión debido a impedimentos estéricos e interacciones electrostáticas desfavorables. [5] La APH(3') se encuentra principalmente en ciertas especies de bacterias grampositivas . [6] [7] [8]
Esta enzima pertenece a la familia de las transferasas , específicamente a aquellas que transfieren grupos que contienen fósforo ( fosfotransferasas ) con un grupo alcohol como aceptor. El nombre sistemático de esta clase de enzimas es ATP:kanamicina 3'-O-fosfotransferasa . Esta enzima también se denomina neomicina-kanamicina fosfotransferasa . [9]
La APH(3') favorece termodinámicamente una forma dimérica de dos monómeros APH(3') idénticos que están conectados por dos enlaces disulfuro entre Cys19 y Cys156, con los sitios activos enfrentados. [2] [10] Sin embargo, la gran distancia entre los sitios activos de los dos monómeros sugiere que son independientes entre sí y no operan de manera cooperativa. Además, la dimerización de APH(3') no afecta la actividad de la enzima. [2] [10] [11]
Cada monómero consta de dos lóbulos, el extremo N rico en láminas beta y el extremo C rico en hélices alfa , con una región de doce aminoácidos que conecta los dos. El lóbulo N-terminal está compuesto por 5 láminas ß antiparalelas , con una hélice α entre las láminas 3 y 4. El lóbulo C-terminal se divide en una región central central (dos hélices α y un bucle de horquilla seguido de cuatro láminas ß), una región de inserción (dos hélices α conectadas por una estructura de bucle) y una región C-terminal (dos hélices α). [11] El bolsillo resultante que está encapsulado por los dos lóbulos constituye el sitio activo de la enzima. [2] Este bolsillo está compuesto en gran parte de residuos de aminoácidos cargados negativamente, que estabilizan la carga positiva y orientan el sustrato en el sitio activo. Además, se cree que esta bolsa contribuye a la promiscuidad de la enzima, permitiéndole absorber y estabilizar varios tipos diferentes de aminoglucósidos. [6]
Aunque estudios anteriores de APH(3') respaldaban un mecanismo que implicaba el ataque nucleofílico del γ-fosfato por el 3'-hidroxilo, estudios más recientes sugieren que APH(3') cataliza la transferencia del γ-fosfato del ATP a un aminoglucósido a través de un mecanismo disociativo , donde la desprotonación del sustrato no es crítica para la transferencia de fosfato, sino la estabilización de un estado de transición de metafosfato . [8] [12] Además, APH(3') tiene un bucle de posicionamiento de nucleótidos (NPL) que se cierra en el sitio activo de la enzima después de unirse al ATP, lo que facilita la fosforilación del grupo 3'-hidroxilo. La clave para posicionar correctamente el grupo fosfato son los residuos Ser27 y Met26. Inicialmente, dos iones de magnesio estabilizados por Asn195 y Asp208 facilitan la unión del ATP en el sitio activo y orientan los grupos ß- y γ-fosfato. Luego, la NPL sufre un cambio conformacional para formar un enlace de hidrógeno entre Ser27 y el grupo β-fosfato. Al unirse al sustrato, APH(3') sufre otro cambio conformacional para orientar a Ser27 de manera que su cadena principal de amida interrumpa la alineación del β-fosfato y el γ-fosfato, debilitando el enlace γ-fosfato. La cadena principal de amida de Met26 forma un enlace de hidrógeno con el metafosfato para estabilizar el estado de transición, ya que un ion magnesio (denominado Mg1) alarga el enlace γ-fosfato, lo rompe y fosforila eficazmente el grupo hidroxilo. [8]
La región central del núcleo de APH(3') tiene un alto grado de similitud conformacional con regiones de serina/tirosina y treonina protein quinasas , enzimas funcionalmente equivalentes que se encuentran en eucariotas. Además, la cristalografía de rayos X y la mutagénesis de residuos clave del sitio activo respaldan las afirmaciones de que APH(3') y las protein quinasas eucariotas están relacionadas, a pesar de compartir menos del 10% del contenido total de residuos. [2] [8] [11] Varios estudios han sugerido que las protein quinasas serina/tirosina/treonina, que alguna vez se pensó que solo ocurrían en eucariotas, también se encuentran en los procariotas. [13] [14] Además, se ha encontrado que la biosíntesis de aminoglucósidos requiere la fosforilación de grupos hidroxilo durante ciertos pasos de la síntesis. Por lo tanto, se ha especulado que la APH(3') y otras proteínas quinasas se originan a partir de enzimas de la vía metabólica de los aminoglucósidos y se desarrollaron para contrarrestar los efectos tóxicos de estos antibióticos en la célula bacteriana huésped. [11] [15]
Los genes de resistencia a los aminoglucósidos se utilizan habitualmente en el ámbito de la ingeniería genética para seleccionar organismos bacterianos transformados correctamente. Al construir un plásmido vector , es fundamental incluir la resistencia a los antibióticos en el vector para expresar eficazmente el gen de interés. Durante las fases de crecimiento se añaden antibióticos, como los aminoglucósidos kanamicina o neomicina , a los cultivos para destruir selectivamente las células que no absorbieron eficazmente el plásmido.
