En biología, un ensayo de ADN ramificado es un ensayo de amplificación de señal (a diferencia de un ensayo de amplificación de objetivo) que se utiliza para detectar moléculas de ácido nucleico . [1]
Un ensayo de ADN ramificado comienza con una placa o algún otro soporte sólido (por ejemplo, una tira reactiva de plástico). La placa está llena de pequeñas moléculas (o cadenas) de ADN monocatenario que sobresalen en la solución. Estas se conocen como moléculas de ADN de sonda de captura. A continuación, se agrega una molécula de ADN extensor. Cada extensor tiene dos dominios: uno que se hibrida con la molécula de ADN de captura y otro que sobresale por encima de la superficie. El propósito del extensor es doble. Primero, crea más área de superficie disponible para que las moléculas de ADN objetivo se unan y, segundo, permite que el ensayo se adapte fácilmente para detectar una variedad de moléculas de ADN objetivo.
Una vez que las moléculas de captura y de extensión están en su lugar y se han hibridado, se puede agregar la muestra. Las moléculas objetivo en la muestra se unirán a la molécula extensora. Esto da como resultado una base llena de sondas de captura, que se hibridan con sondas extensoras, que a su vez se hibridan con moléculas objetivo.
En este punto, se produce la amplificación de la señal. Se añade una molécula de ADN extensora de etiqueta que tiene dos dominios (similar al primer extensor). El extensor de etiqueta se hibrida con el objetivo y con una molécula preamplificada. La molécula preamplificadora tiene dos dominios. Primero, se une al extensor de etiqueta y segundo, se une a la molécula amplificadora. Un ejemplo de molécula amplificadora es una cadena de oligonucleótidos unida a la enzima fosfatasa alcalina .
Diagramáticamente, el proceso puede resumirse como
Base → Sonda de captura → Extensor → Objetivo → extensor de etiquetas → preamplificador → amplificador
El ensayo se puede utilizar para detectar y cuantificar muchos tipos de ARN o ADN diana. En el ensayo, el ADN ramificado se mezcla con una muestra que se va a analizar. La detección se realiza utilizando un método no radiactivo y no requiere la preamplificación del ácido nucleico que se va a detectar. El ensayo se basa completamente en la hibridación. Las enzimas se utilizan para indicar el grado de hibridación, pero no se utilizan para manipular los ácidos nucleicos. Por lo tanto, se pueden detectar y cuantificar pequeñas cantidades de un ácido nucleico sin un paso de transcripción inversa (en el caso del ARN) y/o PCR . El ensayo se puede ejecutar como un ensayo de alto rendimiento, a diferencia del Northern-blotting cuantitativo o el ensayo de protección de la ARNasa, que requieren mucha mano de obra y, por lo tanto, son difíciles de realizar en una gran cantidad de muestras. La otra técnica importante de alto rendimiento empleada en la cuantificación de moléculas de ARN específicas es la PCR cuantitativa , después de la transcripción inversa del ARN a ADNc .
En un ensayo de ADN ramificado se utilizan varias moléculas de ADN monocatenario cortas diferentes ( oligonucleótidos ). El oligonucleótido de captura y el extensor de captura se unen al ácido nucleico diana y lo inmovilizan sobre un soporte sólido. A continuación, el oligonucleótido marcador y el ADN ramificado detectan el ácido nucleico diana inmovilizado. La inmovilización de la diana sobre un soporte sólido facilita un lavado exhaustivo, lo que reduce los resultados falsos positivos. Después de la unión de la diana al soporte sólido, puede detectarse mediante ADN ramificado que está acoplado a una enzima (por ejemplo, fosfatasa alcalina). El ADN ramificado se une al ácido nucleico de muestra mediante hibridación específica en áreas que no están ocupadas por híbridos de captura. La ramificación del ADN permite una decoración muy densa del ADN con la enzima, lo que es importante para la alta sensibilidad del ensayo [ cita requerida ] . La enzima cataliza una reacción de un sustrato que genera luz (detectable en un luminómetro). La cantidad de luz emitida aumenta con la cantidad de ácido nucleico específico presente en la muestra. El diseño del ADN ramificado y la forma en que se hibrida con el ácido nucleico que se va a investigar difiere entre las diferentes generaciones del ensayo de bDNA. [2] A pesar del hecho de que el material de partida no está preamplificado, los ensayos de bDNA pueden detectar menos de 100 copias de ARN del VIH por ml de sangre. [2] Una publicación reciente en Nature Scientific Reports utiliza los niveles de cfDNA como un predictor de la eficacia de la quimioterapia en el tratamiento de cánceres avanzados y utiliza el enfoque del ADN ramificado para amplificar la señal del cfDNA que se produce en trazas. [3]