La polimerasa Taq es una ADN polimerasa I termoestable que recibe su nombre delmicroorganismo eubacteriano termófilo Thermus aquaticus , del que fue aislada originalmente por Chien et al. en 1976. [1] Su nombre suele abreviarse como Taq o Taq pol . Se utiliza con frecuencia en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), un método para amplificar en gran medida la cantidad de segmentos cortos de ADN .
T. aquaticus es una bacteria que vive en fuentes termales y fuentes hidrotermales , y la Taq polimerasa fue identificada [1] como una enzima capaz de soportar las condiciones desnaturalizantes de proteínas (alta temperatura) requeridas durante la PCR. [2] Por lo tanto, reemplazó a la ADN polimerasa de E. coli utilizada originalmente en la PCR. [3]
La temperatura óptima de actividad de Taq es de 75 a 80 °C, con una vida media de más de 2 horas a 92,5 °C, 40 minutos a 95 °C y 9 minutos a 97,5 °C, y puede replicar una cadena de ADN de 1000 pares de bases en menos de 10 segundos a 72 °C. [4] A 75-80 °C, Taq alcanza su tasa de polimerización óptima de aproximadamente 150 nucleótidos por segundo por molécula de enzima, y cualquier desviación del rango de temperatura óptimo inhibe la tasa de extensión de la enzima. Una sola Taq sintetiza aproximadamente 60 nucleótidos por segundo a 70 °C, 24 nucleótidos/seg a 55 °C, 1,5 nucleótidos/seg a 37 °C y 0,25 nucleótidos/seg a 22 °C. A temperaturas superiores a 90 °C, la Taq muestra muy poca o ninguna actividad, pero la enzima en sí no se desnaturaliza y permanece intacta. [5] La presencia de ciertos iones en el recipiente de reacción también afecta la actividad específica de la enzima. Pequeñas cantidades de cloruro de potasio (KCl) e iones de magnesio (Mg 2+ ) promueven la actividad enzimática de la Taq . La polimerasa Taq se activa al máximo a 50 mM de KCl, mientras que la concentración óptima de Mg 2+ está determinada por la concentración de trifosfatos de nucleósidos (dNTP). Las altas concentraciones de KCl y Mg 2+ inhiben la actividad de la Taq . [6] El quelante de iones metálicos común EDTA se une directamente a la Taq en ausencia de estos iones metálicos. [7]
Una de las desventajas de Taq es su falta de actividad de corrección de errores de la exonucleasa 3' a 5' [4], lo que resulta en una fidelidad de replicación relativamente baja. Originalmente, su tasa de error se midió en aproximadamente 1 en 9000 nucleótidos. [8] Se han aislado algunas ADN polimerasas termoestables de otras bacterias y arqueas termófilas, como la ADN polimerasa Pfu , que posee una actividad de corrección de errores, y se están utilizando en lugar de (o en combinación con) Taq para la amplificación de alta fidelidad. [9] La fidelidad puede variar ampliamente entre Taqs, lo que tiene profundos efectos en aplicaciones de secuenciación posteriores. [10]
Taq produce productos de ADN que tienen salientes A ( adenina ) en sus extremos 3'. Esto puede ser útil en la clonación TA , mediante la cual se utiliza un vector de clonación (como un plásmido ) que tiene un saliente T ( timina ) en sus extremos 3', que se complementa con el saliente A del producto de PCR, lo que permite la ligación del producto de PCR en el vector plasmídico.
A principios de los años 1980, Kary Mullis trabajaba en Cetus Corporation en la aplicación de ADN sintético a la biotecnología . Estaba familiarizado con el uso de oligonucleótidos de ADN como sondas para la unión a cadenas de ADN objetivo, así como su uso como cebadores para la secuenciación de ADN y la síntesis de ADNc . En 1983, comenzó a utilizar dos cebadores, uno para hibridar con cada cadena de un ADN objetivo, y añadiendo ADN polimerasa a la reacción. Esto condujo a la replicación exponencial del ADN , [11] amplificando en gran medida segmentos discretos de ADN entre los cebadores. [3]
Sin embargo, después de cada ronda de replicación, la mezcla debe calentarse por encima de los 90 °C para desnaturalizar el ADN recién formado, lo que permite que las cadenas se separen y actúen como plantillas en la siguiente ronda de amplificación. Este paso de calentamiento también inactiva la ADN polimerasa que se utilizaba antes del descubrimiento de la Taq polimerasa, el fragmento Klenow (obtenido de E. coli ). La Taq polimerasa es adecuada para esta aplicación porque puede soportar la temperatura de 95 °C que se requiere para la separación de las cadenas de ADN sin desnaturalizarse.
El uso de la Taq termoestable permite realizar la PCR a alta temperatura (~60 °C y más), lo que facilita una alta especificidad de los cebadores y reduce la producción de productos no específicos, como el dímero de cebadores . Además, el uso de una polimerasa termoestable elimina la necesidad de agregar una nueva enzima a cada ronda de termociclado. Se puede utilizar un solo tubo cerrado en una máquina relativamente simple para llevar a cabo todo el proceso. Por lo tanto, el uso de la polimerasa Taq fue la idea clave que hizo que la PCR fuera aplicable a una gran variedad de problemas de biología molecular relacionados con el análisis de ADN. [2]
Hoffmann-La Roche finalmente compró las patentes de PCR y Taq de Cetus por 330 millones de dólares, de los cuales pudo haber recibido hasta 2 mil millones de dólares en regalías. [12] En 1989, la revista Science nombró a la polimerasa Taq como su primera " Molécula del Año ". Kary Mullis recibió el Premio Nobel de Química en 1993, el único otorgado por investigación realizada en una empresa de biotecnología . A principios de la década de 1990, la técnica de PCR con polimerasa Taq se estaba utilizando en muchas áreas, incluida la investigación de biología molecular básica, las pruebas clínicas y la ciencia forense . También comenzó a encontrar una aplicación apremiante en la detección directa del VIH en el SIDA . [13]
En diciembre de 1999, el juez de distrito estadounidense Vaughn Walker dictaminó que la patente de 1990 relacionada con la polimerasa Taq se había expedido, en parte, sobre la base de información engañosa y afirmaciones falsas de científicos de Cetus Corporation . El fallo respaldó una impugnación de Promega Corporation contra Hoffman-La Roche , que compró las patentes de Taq en 1991. El juez Walker citó descubrimientos previos de otros laboratorios, incluido el laboratorio del profesor John Trela en el departamento de ciencias biológicas de la Universidad de Cincinnati , como base para el fallo. [14]
La Taq Pol A tiene una estructura general similar a la de la PolA de E. coli . El dominio de exonucleasa 3'–5' central, responsable de la corrección de errores, ha cambiado drásticamente y no es funcional. [15] Tiene un dominio de exonucleasa 5'-3' funcional en el extremo amino, que se describe a continuación. Los dos dominios restantes actúan en coordinación, a través del movimiento de dominios acoplados. [16]
La exonucleasa de la polimerasa Taq es un dominio que se encuentra en el extremo amino terminal de laADN polimerasa Taq I (termoestable). Asume un motivo similar al de la ribonucleasa H. El dominio confiere actividad exonucleasa 5' -3' a la polimerasa. [17]
A diferencia del mismo dominio en E. coli , que degradaría los cebadores y debe eliminarse mediante digestión para su uso en PCR, [9] no se dice que este dominio degrade el cebador. [18] Esta actividad se utiliza en la sonda TaqMan : a medida que se forman las cadenas hijas, las sondas complementarias a la plantilla entran en contacto con la polimerasa y se escinden en piezas fluorescentes. [19]
La polimerasa Taq se une en la hendidura del sitio activo de la polimerasa con el extremo romo del ADN dúplex. Como la polimerasa Taq está en contacto con el ADN unido, sus cadenas laterales forman enlaces de hidrógeno con las purinas y pirimidinas del ADN. La misma región de la polimerasa Taq que se ha unido al ADN también se une con la exonucleasa. Estas estructuras unidas a la polimerasa Taq tienen diferentes interacciones.
Se ha informado de un experimento de mutagénesis dirigida al sitio que mejora la actividad de la exonucleasa vestigial 3'-5' en un factor de 2, pero nunca se informó si al hacerlo se reduce la tasa de error. [20] Siguiendo una línea de pensamiento similar, se han creado proteínas quimeras seleccionando dominios de E. coli , Taq y polimerasa I de T. neapolitana . El intercambio del dominio vestigial por uno funcional de E. coli creó una proteína con capacidad de corrección de pruebas pero una temperatura óptima más baja y baja termoestabilidad. [21]
Se han producido versiones de la polimerasa sin el dominio exonucleasa 5'-3', entre las que se encuentran las más conocidas Klentaq o el fragmento Stoffel . La ausencia total de actividad exonucleasa hace que estas variantes sean adecuadas para cebadores que presentan una estructura secundaria, así como para copiar moléculas circulares. [9] Otras variaciones incluyen el uso de Klentaq con una polimerasa de alta fidelidad, una termosecuenciana que reconoce sustratos como lo hace la ADN polimerasa T7 , mutantes con mayor tolerancia a los inhibidores o versiones "etiquetadas con dominio" que tienen un motivo adicional de hélice-horquilla-hélice alrededor del sitio catalítico para sujetar el ADN con más fuerza a pesar de las condiciones adversas. [22]
Debido a las mejoras que la polimerasa Taq proporcionó en la replicación de ADN por PCR: mayor especificidad, menos productos no específicos y procesos y equipos más simples, ha sido fundamental en los esfuerzos realizados para detectar enfermedades. “El uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en el diagnóstico de enfermedades infecciosas, ha resultado en una capacidad para diagnosticar temprano y tratar adecuadamente enfermedades debido a patógenos exigentes, determinar la susceptibilidad antimicrobiana de organismos de crecimiento lento y determinar la cantidad de infección”. [23] La implementación de la polimerasa Taq ha salvado innumerables vidas. Ha cumplido un papel esencial en la detección de muchas de las peores enfermedades del mundo, incluyendo: tuberculosis, faringitis estreptocócica, neumonía atípica, SIDA, sarampión, hepatitis e infecciones urogenitales ulcerativas. La PCR, el método utilizado para recrear copias de muestras de ADN específicas, hace posible la detección de enfermedades al apuntar a una secuencia de ADN específica de un patógeno objetivo de la muestra de un paciente y amplificar cantidades traza de las secuencias indicativas copiándolas hasta miles de millones de veces. Aunque este es el método más preciso para detectar enfermedades, especialmente el VIH, no se realiza con tanta frecuencia como otras pruebas inferiores debido al costo relativamente alto, la mano de obra y el tiempo requeridos. [24]
La dependencia de la polimerasa Taq como catalizador del proceso de replicación de la PCR se ha puesto de relieve durante la pandemia de COVID-19 de 2020. La escasez de la enzima necesaria ha afectado a la capacidad de los países de todo el mundo para producir kits de prueba para el virus. Sin la polimerasa Taq , el proceso de detección de la enfermedad es mucho más lento y tedioso. [25]
A pesar de las ventajas de utilizar la polimerasa Taq en la detección de enfermedades mediante PCR, la enzima no está exenta de defectos. Las enfermedades retrovirales (VIH, HTLV-1 y HTLV-II) a menudo incluyen mutaciones de guanina a adenina en su genoma. Mutaciones como estas son las que permiten que las pruebas de PCR detecten las enfermedades, pero la tasa de fidelidad relativamente baja de la polimerasa Taq hace que se produzca la misma mutación de G a A y posiblemente produzca un resultado positivo falso. [26]
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