ADN polimerasa Φ29

Enzima del bacteriófago ϕ29

La ADN polimerasa Φ29 es una enzima del bacteriófago Φ29 . Se utiliza cada vez más en biología molecular para procedimientos de amplificación de ADN por desplazamiento múltiple y tiene una serie de características que la hacen especialmente adecuada para esta aplicación. Fue descubierta y caracterizada por los científicos españoles Luis Blanco y Margarita Salas .

Replicación del ADN Φ29

Φ29 es un bacteriófago de Bacillus subtilis con un genoma de ADN lineal secuenciado de 19.285 pares de bases. ^[1] Cada extremo 5' está unido covalentemente a una proteína terminal, que es esencial en el proceso de replicación al actuar como cebador para la ADN polimerasa viral. Se ha sugerido un modo simétrico de replicación, por el cual la iniciación cebada por proteína ocurre de manera no simultánea desde cualquiera de los extremos del cromosoma; esto involucra dos orígenes de replicación y dos monómeros de polimerasa distintos. La síntesis es continua e involucra un mecanismo de desplazamiento de hebra. Esto fue demostrado por la capacidad de la enzima para continuar copiando el genoma circular cebado individualmente del fago M13 más de diez veces en una sola hebra (más de 70 kb en una sola hebra). ^[2] Los experimentos in vitro han demostrado que la replicación de Φ29 puede continuar hasta completarse con los únicos requisitos de proteína del fago de la polimerasa y la proteína terminal. ^[2] La polimerasa cataliza la formación del complejo de iniciación entre la proteína terminal y los extremos del cromosoma en un residuo de adenina. A partir de aquí, puede producirse una síntesis continua.

La polimerasa

La polimerasa es una proteína monomérica con dos dominios funcionales distintos. Los experimentos de mutagénesis dirigida al sitio respaldan la proposición de que esta proteína muestra una similitud estructural y funcional con el fragmento Klenow de la enzima polimerasa I de Escherichia coli ; ^{[3] comprende un dominio polimerasa C-terminal y un dominio N-terminal espacialmente separado con una actividad} exonucleasa 3'-5' . ^{[ cita requerida ]}

La enzima aislada no tiene actividad helicasa intrínseca pero puede llevar a cabo una función equivalente por medio de su fuerte unión al ADN monocatenario , particularmente con preferencia al ácido nucleico bicatenario. Esta es la propiedad de esta enzima que la hace favorablemente aplicable a la Amplificación por Desplazamiento Múltiple . La enzima facilita la "desramificación" del ADN bicatenario. ^{[2] La escisión} del desoxirribonucleósido trifosfato que ocurre como parte del proceso de polimerización probablemente proporciona la energía requerida para este mecanismo de desenrollado. ^[4] La naturaleza continua de la síntesis de la cadena (en comparación con la síntesis asimétrica observada en otros organismos) probablemente contribuye a esta procesividad mejorada. La actividad de corrección de pruebas conferida por el dominio de exonucleasa se demostró al mostrar la escisión preferencial de un nucleótido no coincidente del extremo 3' de la cadena recién sintetizada. ^[5] La actividad exonucleasa de la enzima es, al igual que su actividad de polimerización, altamente procesiva y puede degradar oligonucleótidos monocatenarios sin disociación. La cooperación o una "competencia delicada" entre estos dos dominios funcionales es esencial para asegurar una elongación precisa a una velocidad óptima. La actividad exonucleasa de la enzima impide su capacidad de polimerización; la inactivación de la actividad exonucleasa por mutagénesis dirigida al sitio significó que se requirió una concentración de dNTP 350 veces menor para lograr las mismas velocidades de elongación del cebador observadas en la enzima de tipo salvaje . ^[5]

Amplificación del genoma completo

La enzima polimerasa Φ29 ya se utiliza en procedimientos de amplificación por desplazamiento múltiple (MDA) (incluidos varios kits comerciales) mediante los cuales se pueden producir fragmentos de decenas de kilobases de longitud a partir de cebadores hexaméricos no específicos que se unen a intervalos a lo largo del genoma. La enzima tiene muchas propiedades deseables que la hacen apropiada para la amplificación del genoma completo (WGA) mediante este método. ^[6]

• Alta procesividad. ^[2]
• Actividad de corrección de pruebas. ^[5] Se cree que es 1 o 2 órdenes de magnitud menos propensa a errores que la polimerasa Taq. ^[7]
• Genera fragmentos grandes, de más de 10 kb.
• Produce más ADN que los métodos basados ​​en PCR, en aproximadamente un orden de magnitud. ^[8]
• Requiere una cantidad mínima de plantilla; 10 ng son suficientes.
• Nuevo mecanismo de replicación: amplificación por desplazamiento de múltiples cadenas.
  • Se pueden utilizar cebadores aleatorios (hexámeros), sin necesidad de diseñar cebadores específicos ni regiones específicas.
  • No es necesario realizar ciclos térmicos.
• Buena cobertura y un sesgo de amplificación reducido en comparación con los métodos basados ​​en PCR. Se especula que es el método WGA menos sesgado en uso. ^[8]

Referencias

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Lectura adicional

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